AGEs對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病已成為人類健康的一大殺手，其并發(fā)癥具有高發(fā)病率和致死率。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是糖尿病血管病變的主要病理機(jī)制。晚期終末糖基化產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cell，VSMCs）的增殖與遷移，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展，在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。自噬(

2、Autophagy)及線粒體能量代謝方式的改變?cè)赩SMCs的增殖和遷移中發(fā)揮重要調(diào)控作用，然而，其中具體機(jī)制尚不清楚。本研究主要探討AGEs對(duì)VSMCs內(nèi)自噬及線粒體能量代謝的影響，以及它們?cè)赩SMCs增殖和遷移過(guò)程中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　1、提取原代大鼠VSMCs后，傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)采用3-8代細(xì)胞;通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立CatD穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的原代VSMCs。
　　2、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用

3、MTT實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)、EdU染色實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖情況;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期。
　　3、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室檢測(cè)VSMCs遷移能力;計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)目，繪制遷移細(xì)胞指數(shù)曲線。
　　4、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用Western blotting檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表達(dá)水平以及CatD和呼吸鏈復(fù)合酶體Ⅰ-Ⅴ的

4、表達(dá)水平。
　　5、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用EdU熒光染料染色，熒光顯微鏡下觀察LC3-Ⅱ點(diǎn)簇狀數(shù)量及分布情況。
　　6、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用AO和MDC等熒光染料染色，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡以及自噬溶酶體的變化。
　　7、用海馬生物能量分析儀檢測(cè)基礎(chǔ)線粒體能量代謝情況;用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，觀察其對(duì)基礎(chǔ)氧耗、最大呼吸儲(chǔ)備、剩余呼吸儲(chǔ)備、ATP相關(guān)氧耗、質(zhì)子漏

5、、非線粒體相關(guān)氧耗、氧氣消耗率和胞外酸化率的影響。
　　8、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用Mitotracker和TMRE等熒光染料染色，檢測(cè)線粒體活性及膜電位水平的變化。
　　9、用25μg/ml的AGEs處理VSMCs，用western blot檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅴ表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1、 AGEs顯著促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移。
　　2、 AGEs顯著促進(jìn)VSMCs

6、內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和P62的表達(dá)水平，增加細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡的累積。
　　3、 AGEs以顯著降低VSMCs內(nèi)CatD的表達(dá)水平。
　　4、過(guò)表達(dá)CatD后能夠抑制自噬溶酶體的降解。
　　5、過(guò)表達(dá)CatD后能夠抑制AGEs導(dǎo)誘的VSMCs的增殖能力。
　　6、 CatD對(duì)于AGEs誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力無(wú)影響。
　　7、 AGEs處理VSMCs后，氧氣消耗率(OCR)顯著降低，胞外酸化率(EACR)顯

7、著增加。
　　8、 AGEs處理VSMCs后，線粒體活性及膜電位明顯減低。
　　9、 AGEs處理VSMCs后，呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ/Ⅴ表達(dá)水平顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1、在VSMCs中，AGEs通過(guò)與CatD相互作用，抑制自噬溶酶體的降解，從而促進(jìn)VSMCs增殖。
　　2、在VSMCs中，AGEs能夠促進(jìn)VSMCs遷移，但不是通過(guò)CatD發(fā)揮作用。
　　3、在VSMCs中，AGEs能夠通過(guò)改變線粒