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文檔簡介
1、在成人的深度創(chuàng)面修復的過程中,疤痕形成或纖維化產(chǎn)生是不可避免的結(jié)局,難以達到無瘢痕愈合。由于瘢痕可致軀干、四肢的形態(tài)及功能異常,引起不同程度的心理障,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量,是臨床上面臨的主要問題,如何有效的控制瘢痕的增生及其相關(guān)機制研究一直是研究的熱點、難點問題之一。
大量的文獻表明,巨噬細胞作為一種免疫細胞,通過分泌某些因子,在創(chuàng)面修復及后期的纖維化發(fā)生都起到了促進作用。巨噬細胞具有吞噬病原菌、分泌炎性因子、生長因子等發(fā)
2、揮抗炎、清除壞死組織、促進創(chuàng)面愈合等功能。近年來通過消化的方法從人和鼠的創(chuàng)面分離巨噬細胞表明在組織修復過程中,在不同的環(huán)境刺激下,巨噬細能獲得多種表型和不同的功能。在創(chuàng)面愈合過程巨噬細胞能表達M1和M2型標記。創(chuàng)面愈合的炎癥反應期主要為M1巨噬細胞,主要分泌炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用。創(chuàng)面愈合的中后期主要為M2巨噬細胞,主要分泌大量的生長因子發(fā)揮促生長作用。
真核起始因子6(eIF6,Eukaryotic initiation fa
3、ctor6)是一種新發(fā)現(xiàn)的能夠?qū)φ婧松锏鞍踪|(zhì)翻譯起調(diào)控作用的因子。在細胞核中,eIF6是核糖體生成不可缺少的一種因子,同時在胞漿中,eIF6與60s亞基聚合形成聚合物,發(fā)揮抗結(jié)合作用,阻止40S亞基與60S亞基結(jié)合,防止成熟的80S亞基形成。這一過程受RACK1-PKC復合物調(diào)控,40S亞基通過RACK1與PKC形成復合物,然后PKC將eIF6 Ser235磷酸化,從而將eIF6從核糖體60s亞基解聚下來,從而形成成熟的80S核糖體亞
4、基,mRNA開始翻譯組裝肽鏈。課題組前期的實驗發(fā)現(xiàn)eIF6對皮膚創(chuàng)面的纖維化具有抑制作用。通過建立eIF6野生型與eIF6+/-兩組小鼠創(chuàng)面愈合的線性模型,結(jié)果顯示:eIF6+/-組小鼠創(chuàng)面肉芽組織增加、膠原沉積增加。同時在肝纖維化模型中,高表達eIF6組膠原沉積明顯少于對照組。
因此我們推測,eIF6可能影響巨噬細胞的功能進而影響創(chuàng)面愈合。我們擬通過基因芯片技術(shù)比較eIF6野生型與eIF6+/-來源的M2巨噬細胞基因表達譜差
5、異,進而探討eIF6影響M2巨噬細胞的哪些關(guān)鍵基因。
研究內(nèi)容和方法:
1、巨噬細胞及M2型巨噬細胞培養(yǎng)通過分離eIF6野生型與eIF6+/-小鼠腹腔巨噬細胞,細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后獲得貼壁的樹枝狀細胞就是我們所需巨噬細胞。然后更換加入IL-4的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時,收集細胞。
2、M2型巨噬細胞表型及功能鑒定用流式細胞儀檢測M2巨噬細胞的表面抗原,用RT-PCR檢測M2型巨噬細胞的精氨酸酶1(argi
6、nase-1)和TGF-β1的表達水平的表達。
3、基因芯片篩選差異基因?qū)⒎謩e來自eIF6野生型與eIF6+/-小鼠的M2巨噬細胞抽提RNA,干冰保存,送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司檢測。實驗所選芯片為(Affymetrix GeneChip Mouse Gene1.0 ST Array)表達譜芯片,實驗均進行三次生物學重復
4、RT-PCR及ELISA:通過提取細胞RNA及培養(yǎng)液上清,用RT-PCR及ELISA從
7、基因RNA及蛋白水平驗證部分感興趣的差異基因。
實驗結(jié)果:
1、通過腹腔灌洗將巨噬細胞的分離,經(jīng)過24小時培養(yǎng)純化后,獲得貼壁的樹枝狀細胞,即為初步分離的腹腔巨噬細胞,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)F4/80和CD11b兩種巨噬細胞表面標記均為陽性,純度為94.4%。
2、IL-4刺激巨噬細胞24小時后,流式細胞檢測發(fā)現(xiàn),CD2O6表達明顯增強,而未見CD11c表達。
3、RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),arginase-1和
8、TGF-β1在IL-4刺激組顯著高于未刺激組。(P<0.05)。
4、通過基因芯片(Affymetrix GeneChip Mouse Gene1.0 ST Array)對eIF6野生型與eIF6+/-M2巨噬細胞表達譜進行檢測,篩選差異基因。挑選出與纖維化相關(guān)的差異基因VEGF,MMP2和TIMP2。eIF6+/-與eIF6野生型之間差異基因比值分別為:VEGF(比值1.33,p<0.05)、MMP2(比值0.70,p<0.
9、05)、TIMP2(比值1.54,p<0.05)。
5、RT-PCR對芯片結(jié)果進行驗證 eIF6+/-與-eIF6野生型相比,VEGF、TIMP2 RNA表達上升(P<0.05),MMP2表達下降(P<0.01),與基因芯片結(jié)果吻合
6、ELISA對芯片結(jié)果進行驗證eIF6野生型與eIF6+/-相比,VEGF、 TIMP2表達明顯上升(P<0.05),MMP表達下降(P<0.01),與基因芯片結(jié)果吻合。
結(jié)
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