中藥材DNA及重金屬快檢技術(shù)研究.pdf

1、目的:本課題通過對中藥材炮制品DNA快速提取、快速PCR擴增以及重金屬含量快速檢測技術(shù)進行研究，建立了中藥材真?zhèn)渭爸亟饘俸康目焖儋|(zhì)量評價體系中的中藥材真?zhèn)舞b別及重金屬含量檢測，為滿足中藥鑒別現(xiàn)場運用系統(tǒng)的快速、簡單、低毒、高效、靈敏等要求提供技術(shù)支撐。
　　方法:1.以氫氧化鈉，1％PVP40和1％TritonⅩ-100配制成堿裂解緩沖液，Tris-HCl為中和液，經(jīng)加熱裂解和中和兩步對地黃酒炙品、槐米炒制品以及加入輔料的炮制品

2、進行DNA提取并進行PCR擴增。在該提取方法的基礎(chǔ)上，選擇試劑盒法和Chelex-100法對槐米炒制品DNA進行純化，用通用引物進行PCR擴增。2.通過對西紅花及其常見摻偽品的葉綠體基因片段psbA-trnH測序和比對分析，找出序列差異，針對差異堿基設(shè)計特異性引物，構(gòu)建PCR擴增反應體系，通過優(yōu)化PCR反應退火、變性溫度及時間，減少循環(huán)數(shù)等條件，選擇高效的DNA聚合酶，縮短PCR反應時間，在PCR產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料

3、，代替凝膠電泳步驟。3.使用不同金屬離子與探針反應，確定兩種探針的選擇性。使用不同濃度銅離子溶液與兩種探針反應，根據(jù)銅離子濃度與熒光強度值作出標準曲線，測定藥材粉末的待測液與Probe混合液的熒光強度值，計算出藥材粉末中金屬離子含量。同時通過ICP-MS和紫外分光光度法分別測定該批次藥材中的銅離子含量與總重金屬含量與探針測量結(jié)果比較。
　　結(jié)果:1.優(yōu)化堿裂解法可簡單快速的提取出地黃酒炙品、醋炙延胡索、酒炙當歸、鹽炙補骨脂、麩炒蒼

4、術(shù)等藥材的DNA?；泵壮粗破诽崛NA濃度為420.61士123.91μg·μL-1，但槐米炒制品在炒制溫度高、時間長的情況下，很難擴增出明顯PCR條帶，通過使用5％ Chelex-100樹脂純化后即可獲得明顯擴增條帶。2.建立了基于psbA-trnH序列的西紅花快速真?zhèn)舞b別體系，優(yōu)化后的PCR反應條件為90℃預變性1min，90℃變性5s，58℃延伸5s，26個循環(huán)。在PCR反應產(chǎn)物中加入染料SYBR GreenⅠ，西紅花正品出現(xiàn)強烈

5、綠色熒光，而偽品無熒光。3.熒光探針B是針對于Cu2+的特異性熒光探針。Probe B與不同濃度銅離子混合后，銅離子濃度在0.6-2.4 mg/L范圍內(nèi)顯綠色熒光，當濃度大于2.4 mg/L時，綠色熒光淬滅。在0-2.4 mg/L范圍內(nèi)銅離子濃度與熒光強度比值的標準曲線為y=6.4395x-6.0247，根據(jù)該曲線得出的銅離子濃度與ICP-MS測出的銅離子濃度進行比較，作出曲線y=4.8471x-0921，據(jù)此可以得出藥材中的銅離子含量

6、。4.熒光探針A是針對與總重金屬離子的含量測定的熒光探針。Probe A與不同濃度鉛離子混合后均顯藍色熒光，在0-4.0 mg/L范圍內(nèi)鉛離子濃度與熒光強度比值的標準曲線為y=0.1165x+0.5413，根據(jù)該曲線得出的鉛離子濃度與紫外分光光度法測出的總重金屬含量進行比較，作出曲線y=1.2335x+28.355，據(jù)此可以得出藥材中的銅離子含量。
　　結(jié)論:優(yōu)化堿裂解法能夠快速、安全的提取中藥材炮制品的DNA;位點特異性PCR方