無融合生殖龍須草SSR分析和遺傳學(xué)研究.pdf

1、龍須草(Eulaliopsisbinata)是多年生禾本科兼性無融合生殖植物，其無融合生殖程度較高，胚和胚乳不需要受精能夠自發(fā)形成，是利用無融合生殖固定禾谷類作物雜種優(yōu)勢(shì)的潛在資源。開發(fā)有效的分子標(biāo)記，尋找與其無減數(shù)胚囊形成、孤雌生殖、胚乳自發(fā)產(chǎn)生等性狀連鎖的分子標(biāo)記，是進(jìn)一步研究其無融合生殖遺傳和分子機(jī)理的基礎(chǔ)。本研究以來自中國(guó)5個(gè)省12個(gè)不同居群的龍須草為材料，從分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)角度研究其無融合生殖特點(diǎn)。采用三種不同方法開

2、發(fā)龍須草SSR引物，并利用篩選的多態(tài)性SSR引物和RAPD引物同時(shí)對(duì)雜交F1代分析，尋找不同生殖方式的單株及與生殖方式連鎖的分子標(biāo)記。通過去雄、雜交等田間遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀對(duì)種子中胚和胚乳細(xì)胞倍性的檢測(cè)，確定龍須草中有性生殖和無融合生殖單株，為龍須草無融合生殖遺傳機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1.建立了適合龍須草的SSR反應(yīng)體系：2×buffer：2μl；2.0mmol/LMg2+；0.2mmol/LdNTPs；0.3

3、μmol/LSSR引物；80ng模板DNA和0.5UTaq酶。 2.通過錨定PCR開發(fā)復(fù)合SSR位點(diǎn)的方法，在設(shè)計(jì)的33對(duì)引物中篩選到有效擴(kuò)增的引物13對(duì)。引物開發(fā)效率大約36％。13對(duì)引物中表現(xiàn)多態(tài)性的引物有6對(duì)。利用基因特異序列法得到多態(tài)性引物3個(gè)。在使用的18對(duì)近源物種引物中有83％的SSR引物在供試的12個(gè)居群龍須草中都有清晰的SSR條帶出現(xiàn)，其中10對(duì)(56％)引物表現(xiàn)出多態(tài)性。 3.使用所開發(fā)的多態(tài)性SSR引

4、物和RAPD引物對(duì)廣東星子與陜西山陽(yáng)居群雜交后代(F1代)進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果在后代中發(fā)現(xiàn)了五種表現(xiàn)類型：①與兩親本相比有缺失帶；②雙親的互補(bǔ)帶型；③偏父本帶型；④偏母本帶型；⑤不同于親本的變異帶型。這些結(jié)果揭示了龍須草雜交后代生殖方式以無融合生殖為主，呈現(xiàn)出多樣性的特點(diǎn)。 4.以直接套袋和去雄套袋作為對(duì)照，消除由于人工操作對(duì)結(jié)實(shí)率的影響。直接套袋的結(jié)實(shí)率顯著高于去雄套袋和去雄雜交的結(jié)實(shí)率。表明人工去雄影響子房發(fā)育，降低了結(jié)實(shí)

5、率。同時(shí)也說明人工去雄具有一定的可信度。去雄套袋較低的結(jié)實(shí)率說明其中有專性無融合生殖發(fā)生。去雄雜交結(jié)實(shí)率顯著高于去雄套袋結(jié)實(shí)率，說明假受精或者有性生殖的發(fā)生促進(jìn)了種子的形成，而花粉在其中發(fā)揮了重要作用。 5.利用流式細(xì)胞儀對(duì)廣東星子和湖南衡陽(yáng)居群內(nèi)各單株自然結(jié)實(shí)種子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示星子14、衡陽(yáng)11單株種子中胚與胚乳細(xì)胞的DNA相對(duì)含量倍性比為2C:3C，其它單株為2C:3C:4C。表明星子14、衡陽(yáng)11單株的種子可能來自有性