肺表面活性蛋白B前肽proSP-B的重組表達及抗菌活性研究.pdf

1、proSP-B(Precursor Surfactant Protein B)是肺表面活性蛋白B的前肽，其作為一個前體蛋白，在形成和調節(jié)肺表面活性蛋白B的形成過程中發(fā)揮著極其重要的作用。由于proSP-B蛋白氨基酸序列的疏水性和其結構的獨特性，研究學者將其歸為鞘脂激活蛋白樣蛋白(Saposin-Like Proteins,SAPLIPs)超家族的一員，SAPLIPs家族成員作為一類具有獨特結構的蛋白族群，具有非常廣譜的生物學功能，而抗菌

2、活性是其最為重要的功能之一。而近幾年來，隨著抗生素在食品及醫(yī)藥衛(wèi)生領域的濫用及不合理使用,引起了耐藥、泛耐藥、交叉耐藥，甚至是超級細菌的不斷出現(xiàn),使得抗感染問題變的越來越嚴峻，而抗生素的毒副作用也使得人類的健康及生命安全面臨極大威脅。因此，開發(fā)一類新的高效，低毒，具有新的抗菌作用機制的藥物迫在眉睫?？咕淖鳛橐活愑缮矬w自身生理活動產(chǎn)生的，具有廣譜抗菌活性的小分子物質，日漸成為替代傳統(tǒng)抗生素的一類新型抗菌藥物。
　　在本實驗研究中

3、，我們利用基因工程技術構建了pGEX4T-1-proSP-B原核表達載體，并用IPTG成功誘導表達并純化出proSP-B蛋白，分析proSP-B蛋白在CCL149細胞中的定位和毒性作用，為proSP-B蛋白的抗菌作用及作用機理奠定基礎；接著濾紙片法檢測proS-B蛋白對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抗菌活性，再以金黃色葡萄球菌為試驗菌，考察蛋白的抗菌作用機理，為

4、開發(fā)新型的抗菌藥物奠定基礎。
　　目的：本課題旨在研究通過基因工程技術構建、表達、純化獲得proSP-B重組蛋白，分析其毒性和抗菌活性及抗菌機制，為將proSP-B開發(fā)成一種新型的抗菌藥物奠定理論和實驗基礎。
　　方法：
　?。?）構建pGEX4T-1-proSP-B原核表達載體，分析proSP-B融合表達特性。proSP-B的氨基酸序列疏水性較強，較難通過化學合成的方式獲得，實驗中通過基因工程的方法將目的基因proS

5、P-B構建到pGEX4T-1質粒上，然后利用IPTG誘導表達，SDS-PAGE、Western Blot檢測proSP-B的表達，并純化獲得proSP-B蛋白。
　?。?）考察proSP-B蛋白的細胞熒光定位及細胞毒性。構建真核表達載體pEGFP-N2-proSP-B，然后將真核表達載體轉染到CCL149細胞中，利用載體上攜帶
　　的GFP基因，結合DAPI核染與DiI細胞膜染色，分析proSP-B在細胞中的定位。將CCL1

6、49細胞與proSP-B蛋白共孵育考察proSP-B蛋白的細胞毒性。
　　（3）proSP-B蛋白的抗菌活性研究。培養(yǎng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，然后用濾紙片擴散法考察proSP-B蛋白的抗菌活性及抗菌譜。
　?。?）proSP-B蛋白抗菌機理研究。選用金黃色葡萄球菌作為考察試驗菌，利用碘化丙啶（PI）染色法和乳酸脫氫酶（LDH）酶活測定的方法研究

7、分析proSP-B蛋白的抗菌機理。
　　結果：
　?。?）成功構建了proSP-B原核表達載體，并采用在延長表達時間的方法，成功促進重組proSP-B蛋白的可溶性表達，并純化了proSP-B蛋白，應用BCA法測定其蛋白濃度為1 mg/mL。
　?。?）利用分子生物學技術成功構建了融合表達載體pEGFP-N2-proSPB，發(fā)現(xiàn)GFP-proSP-B表達的綠色熒光蛋白主要定位在CCL149細胞的細胞膜上，而單獨表達GFP

8、的綠色熒光則分布在CCL149細胞的細胞胞質中，說明proSP-B能在CCL149細胞中特異性表達，并定位在細胞膜上而發(fā)揮其膜結合性功能。
　?。?）利用蛋白與細胞共培養(yǎng)的方式確定了proSP-B蛋白的細胞毒性，其IC50約為1595μg/mL，根據(jù)細胞毒性分級評價標準初步確定proSP-B蛋白的細胞毒性是低毒的。
　?。?）通過濾紙片法成功測定了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌、耐甲氧西林金

9、黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌對proSP-B蛋白的敏感性，并分別計算出其MIC值。發(fā)現(xiàn)proSP-B蛋白對細菌、真菌均具有一定的抑制作用，且對革蘭陽性菌的作用大于革蘭氏陰性菌，對細菌的作用大于真菌。
　　（5）以金黃色葡萄球菌作為實驗對象，應用PI熒光染色及LDH酶活法初步測定分析proSP-B蛋白的抗菌機理，結合proSP-B的細胞熒光定位，我們初步得出proSP-B發(fā)揮其抗菌活性的作用機理是proSP-B蛋白作用于細菌的細胞膜，