條件性敲除軟骨細(xì)胞Indianhedgehog力學(xué)-生物學(xué)特性變化的研究.pdf

1、目的：
　　與正常細(xì)胞比較，分析敲除Ihh基因的軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的力學(xué)—生物學(xué)特性變化，明確Ihh基因在軟骨細(xì)胞力學(xué)-生物學(xué)特性維持作用。
　　方法：
　　1、取剛出生的Ihhfl/fl純合并具有Col2a1-CreERt2的基因工程小鼠40只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射TM（Tamoxifen），對照組腹腔注射等量的植物油，連續(xù)注射5天后，急性分離肋軟骨細(xì)胞。
　　2、實(shí)時熒光定量PCR（R

2、T-PCR）檢測Ihh基因相對表達(dá)量，明確Ihh基因的敲除效率。
　　3、CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測同一時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組肋軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡（n=10）。
　　4、RT-PCR檢測Col I、Gli-1、Col II、Col X、Agg和Mmp13的mRNA表達(dá)水平的變化（n=5）。
　　5、微管吸吮技術(shù)及半無限體細(xì)胞力學(xué)模型測定Ihh基因敲除后肋軟骨細(xì)胞力學(xué)特性的變化（n=5）。
　　結(jié)果：
　　

3、1、CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，敲除Ihh基因后，軟骨細(xì)胞增殖效率較對照組降低，其中48h、72h最為顯著，450nm波長吸光度分別為（0.534±0.15）、（0.722±0.13）（p<0.05）和（0.758±0.14）、（0.946±0.17）（p<0.05）。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)檢分析發(fā)現(xiàn)：第3天、第5天、第7天的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率較對照組均增加(P<0.05)。
　　3、RT-PCR分析Col II和Agg的mRNA表

4、達(dá)水平較對照組分別增高4.2倍（P<0.01）和3.2倍（P<0.05），Col X和Mmp13的mRNA表達(dá)水平分別降低3.6倍（P<0.01）和2.6倍（P<0.05）。
　　4、微管吸吮及半無限體細(xì)胞力學(xué)模型測定軟骨細(xì)胞力學(xué)特性發(fā)現(xiàn)：瞬時模量（E0）、平衡模量（E∞）、表觀黏性（μ）均相對于對照組較高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　條件性敲除軟骨細(xì)胞Ihh基因后能夠有效的提高軟骨細(xì)胞Col II和Agg的表達(dá)