雙氫青蒿素對(duì)喉癌干細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、喉癌（Laryngeal cancer）是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率正在逐年上升，在東北地區(qū)喉癌能占到所有腫瘤的5.7％-7.6%。喉癌目前的治療包括手術(shù)和放化療、生物治療等多種治療手段有機(jī)的結(jié)合。但是患者的生存并沒有得到很大的改善，腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是患者治療失敗的主要原因。
　　近年來，腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells，CSCs）理論的提出為腫瘤轉(zhuǎn)移的研究提供了新的視角，CSCs的理論認(rèn)為CSCs是存在于腫

2、瘤內(nèi)的極少數(shù)細(xì)胞，充當(dāng)干細(xì)胞的角色，并具有自我更新、多向分化、高致瘤及高轉(zhuǎn)移性的特性，是腫瘤的起源。目前CSCs的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，在白血病以及多種實(shí)體瘤中包括喉癌中都分離出了CSCs。在本研究中，我們從CSCs的角度去分析腫瘤轉(zhuǎn)移可能的來源與機(jī)制。
　　由于CSCs對(duì)多種化療藥物耐藥，產(chǎn)生抵抗，目前許多化療藥物對(duì)喉癌的治療并不十分理想。所以尋求新的抗腫瘤藥物是非常必要的。以前的研究發(fā)現(xiàn)，廣泛用于臨床的抗瘧藥物雙氫青蒿素（D

3、ihydroartemisinin, DHA）是從青蒿素中提取的倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì)的衍生物，可以抑制多種腫瘤包括頭頸腫瘤的生長(zhǎng)，具有安全、高效、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。但DHA對(duì)喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移是否具有抑制作用及機(jī)制目前仍不清楚。所以，我們針對(duì)這兩大問題展開研究，通過體外和在體實(shí)驗(yàn)探討介導(dǎo)喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移的主要細(xì)胞及其DHA對(duì)喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是否有抑制作用及其可能的機(jī)制。
　　第一部分：喉癌CSCs的分離及其體外侵襲和遷移能力的研究
　　

4、目的:比較喉癌Hep-2細(xì)胞系CD133+與CD133-細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移能力方面的差別，并探討其存在差異的機(jī)制。
　　方法：
　　1.用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離出細(xì)胞表面標(biāo)記CD133+及CD133-的喉癌Hep-2細(xì)胞，分別培養(yǎng)后再檢測(cè)陽性細(xì)胞中CD133的陽性表達(dá)率。
　　2.應(yīng)用Transwell小室這項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的差異。
　　3.Westen blot檢測(cè)兩種細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9、

5、E-cadherin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞分選的結(jié)果：PE標(biāo)記的CD133抗體染色后，流式細(xì)胞檢測(cè)顯示喉癌Hep-2細(xì)胞表面CD133的陽性表達(dá)率為3.4±0.559%，無血清培養(yǎng)一周后再經(jīng)流式檢測(cè)CD133+純度測(cè)定為86.5±3.011%。
　　2.Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示：兩種細(xì)胞在traswell小室的上室培養(yǎng)24小時(shí)后，與CD133-細(xì)胞相比，CD133+細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的侵襲、遷

6、移能力（P<0.01）。
　　3.Western blot結(jié)果：侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9在CD133+細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為（0.87±0.016）明顯高于CD133-細(xì)胞（0.643±0.011），使用T檢驗(yàn)的方法檢測(cè)兩組之間的蛋白相對(duì)表達(dá)量，兩者之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=20.08， P<0.01）。另一種侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)的蛋白E-cadherin與MMP-9相反，在CD133-細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于CD133+細(xì)胞，兩種細(xì)胞

7、中該蛋白的表達(dá)量分別為 CD133+（0.376±0.0200）， CD133-（0.791±0.015），T檢驗(yàn)檢測(cè)兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.49， P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.CD133+喉癌細(xì)胞較CD133-細(xì)胞的侵襲遷移能力更強(qiáng)，可能是在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的主要責(zé)任細(xì)胞。
　　2.CD133+細(xì)胞的高侵襲性可能與CD133+細(xì)胞自身表達(dá)更多的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9以及丟失粘附蛋白E-ca

8、herin有關(guān)。
　　第二部分：DHA通過抑制STAT3信號(hào)途徑干擾喉癌CSCs的侵襲和遷移作用的研究
　　目的：觀察DHA抑制喉癌干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并探討其作為潛在的STAT3抑制劑對(duì)STAT3所激活的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路的阻斷作用。
　　方法：
　　1.將流式分選出的CD133+細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)條件的不同分為4組：（1）無血清培養(yǎng)，不添加任何藥物及激活或干擾因子（對(duì)照組）；（2）在（1）的基礎(chǔ)之上加入細(xì)胞因子

9、IL-6（20ng/ml）；（3）先加入IL-6作用1h，然后再加入DHA；（4）在（1）的基礎(chǔ)上只加入藥物DHA。同理，用另外一個(gè)條件低氧進(jìn)行干預(yù)也分為4組：（1）單純的無血清常氧培養(yǎng)；（2）無血清低氧培養(yǎng)；（3）低氧培養(yǎng)的同時(shí)加入DHA；（4）無血清常氧培養(yǎng)再加入DHA。
　　2.用Transwell小室技術(shù)檢測(cè)上述不同培養(yǎng)條件下CD133+細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量的變化。
　　3.Western blot檢測(cè)上述不同條件（I

10、L-6和低氧）激活STAT3，以及再加入DHA后， HIF-1α（乏氧條件下），STAT3，p-STAT3以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9、E-cadherin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.Transwell結(jié)果：
　　(1)在IL-6和/或DHA外加因素作用后，喉癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的結(jié)果顯示：未處理組即對(duì)照組（162±13）個(gè)/HP，IL-6組（310±13）個(gè)/HP，IL-6+DHA組（57±9）個(gè)/HP，DHA組（4

11、8±6）個(gè)/HP。應(yīng)用單因素方差分析檢測(cè)四組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1184， P<0.01），應(yīng)用Tukey’s multiple comparison test方法比較組內(nèi)兩兩的差別，IL-6組和對(duì)照組相比（q=41.92， P<0.01）,IL-6組和IL-6+DHA聯(lián)合組比較（q=71.28，P<0.01）,對(duì)照組和DHA組相比較（q=32.06，P<0.01）。四組喉癌干細(xì)胞侵襲的結(jié)果：對(duì)照組（107±3）個(gè)/HP，IL-

12、6組（204±7）個(gè)/HP，IL-6+DHA組（44±7）個(gè)/HP， DHA組（30±7）個(gè)/HP方差分析四組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1453, P<0.01)，IL-6組和對(duì)照組相比（q=46.68，P<0.01）,IL-6組和IL-6+DHA聯(lián)合組比較（q=76.79，P<0.01）,對(duì)照組和DHA組相比較（q=37.11， P<0.01）。
　　(2)在低氧和/或DHA作用后，各組喉癌干細(xì)胞經(jīng)Traswell轉(zhuǎn)移的結(jié)果

13、示：常氧組（137±9）個(gè)/HP，低氧組（229±7）個(gè)/HP，低氧+DHA組（59±4）個(gè)/HP，常氧+DHA組（39±5）個(gè)/HP。四組之間單因素方差分析結(jié)果顯示四組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1675，P<0.01），各組之間的比較如下：常氧組和低氧組（q=43.68，P<0.01），低氧組和低氧+DHA組（q=80.57，P<0.01），常氧組和常氧+DHA組（q=46.32，P<0.01）。四組細(xì)胞Transwell侵襲的結(jié)果

14、示：常氧組（122±10）個(gè)/HP，低氧組（190±7）個(gè)/HP，低氧+DHA（58±6）個(gè)/HP，常氧+DHA（39±7）個(gè)/HP，四組之間比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析四組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=705.9，P<0.01)，常氧組和低氧組（q=26.35，P<0.01）,低氧組和低氧+DHA組（q=51.35， P<0.01），常氧組和常氧+DHA組（q=32.19，P<0.01）。
　　2.Western blot結(jié)果：
　　(

15、1)在IL-6和/或DHA作用于喉癌干細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白p-STAT3，STAT3，以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9，E-cadherin在四組中的表達(dá)量的變化，使用單因素方差分析對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。STAT3在四組中的表達(dá)量無明顯差別，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。p-STAT3在四組中表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10190,P<0.01)，組內(nèi)兩兩之間進(jìn)行比較，IL-6作用后較對(duì)照組的表達(dá)量增加（q=20.87，P

16、<0.01）,加入DHA后，IL-6+DHA組較IL-6組的蛋白量又明顯減少（q=183.5，P<0.01），與照組相比該蛋白在DHA組的表達(dá)量也明顯下降（q=165，P<0.01）。MMP-9的表達(dá)趨勢(shì)變化與p-STAT3相似，四組之間的差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7830，P<0.01）,四組之間進(jìn)行比較，在IL-6組表達(dá)最多，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=51.5，P<0.01），而IL-6+DHA組與IL-6組相比，MMP-9的表

17、達(dá)量明顯下降（q=143.7， P<0.01）,單獨(dú)加DHA與對(duì)照組相比也明顯下降了（q=232.9，P<0.01）。E-cadherin的變化趨勢(shì)則與上述兩種蛋白相反，四組之間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1219, P<0.01），IL-6作用后表達(dá)量反而降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=9.845，P<0.01）。該蛋白在IL-6+DHA組較IL-6組的表達(dá)水平明顯升高，差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=59.85，P<0.01）。D

18、HA單獨(dú)組和對(duì)照組比較,E-cadherin的表達(dá)水平升高差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=59.53，P<0.01）。
　　(2)喉癌干細(xì)胞低氧和/或DHA作用后，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白乏氧因子-1α（HIF-1α），p-STAT3和STAT3以及侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9和E-cadherin的表達(dá)量變化。用單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、評(píng)定。HIF-1α在四組中的表達(dá)的差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=350.9，P<0.01

19、）。低氧培養(yǎng)后， HIF-1α的表達(dá)量明顯升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=28.32，P<0.01）。加入DHA后其表達(dá)量顯著下降，低氧+DHA組比低氧組明顯減少（q=8.26，P<0.01），且DHA組和對(duì)照組比較表達(dá)量也顯著降低（q=12.80，P<0.01）。p-STAT3和MMP-9的表達(dá)趨勢(shì)與HIF-1α相似，四組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2187，P<0.01, p-STAT3;F=4833， P<0.01，MMP-

20、9），在低氧培養(yǎng)后均升高，表達(dá)量與相應(yīng)的對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-STAT3（q=34.68，P<0.01），MMP-9（q=45.31，P<0.01）。同樣，在加入DHA后，與相應(yīng)的對(duì)照組比較，這兩種蛋白的表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常氧組和常氧+DHA組相比p-STAT3（q=63.68， P<0.01），低氧和低氧+DHA組相比p-STAT3（q=90.30，P<0.01）,常氧組和常氧+DHA組相比MMP-9（q=11

21、5.7，P<0.01）,低氧組和低氧+DHA組比較MMP-9（q=99.39，P<0.01）。STAT3在四組的表達(dá)水平無明顯差異（P>0.05）。E-cadherin在四組中的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17730， P<0.01）。低氧條件下較常氧時(shí)表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=8.848， P<0.01）。而加入DHA后其相應(yīng)的對(duì)照組E-cadherin的表達(dá)水平呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常氧組和常氧+DHA組比較（q=25

22、8.7， P<0.01），低氧組和低氧+DHA組比較（q=196.1，P<0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.IL-6和低氧的作用可以提高喉癌干細(xì)胞的侵襲、遷移能力。
　　2.DHA可以抑制喉癌干細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與DHA特異性的抑制p-STAT3的激活，從而使得其下游的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)受到影響。
　　第三部分：人喉癌Hep-2細(xì)胞系的CD133-和CD133+細(xì)胞在體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移能力的對(duì)比研究

23、r>　　目的：比較CD133-和CD133+細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲、轉(zhuǎn)移的差異，并檢測(cè)侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，分析可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.將裸鼠隨機(jī)分為2組，分別通過尾靜脈注射CD133-和CD133+細(xì)胞建立轉(zhuǎn)移模型。觀察小鼠的一般情況，并記錄小鼠生存時(shí)間。
　　2.對(duì)各組肺組織HE染色，觀察并計(jì)數(shù)各組肺組織所形成的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。
　　3.Western blot檢測(cè)兩組肺轉(zhuǎn)移灶中侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)情

24、況，分析可能的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠的一般情況：我們所建立的小鼠的侵襲、轉(zhuǎn)移模型對(duì)小鼠的一般情況影響較大，尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞后隨著時(shí)間延長(zhǎng)肺轉(zhuǎn)移灶逐漸形成的過程中，一部分小鼠的體重出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，在生長(zhǎng)期出現(xiàn)了體重下降。CD133-細(xì)胞組的小鼠在第31天有2只開始出現(xiàn)體重下降，第33天有3只開始出現(xiàn)體重下降。CD133+細(xì)胞組的小鼠在第19天有3只，第21天有2只，29天有1只小鼠開始出現(xiàn)體重逐漸下降。在體重下降

25、后，小鼠的活動(dòng)、精神狀態(tài)等也逐漸開始減低。但兩組體重之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2. CD133-和CD133+細(xì)胞分別建立的轉(zhuǎn)移模型中肺轉(zhuǎn)移的情況的比較：CD133-細(xì)胞組肺組織轉(zhuǎn)移程度較輕，肉眼觀察肺組織紅潤(rùn)，表面光滑，而CD133+細(xì)胞組的肺組織表面可見明顯轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成，肺組織略顯蒼白。經(jīng)HE染色后，鏡下觀察兩組肺組織，與CD133-細(xì)胞組相比，CD133+細(xì)胞組肺轉(zhuǎn)移灶明顯較大，且數(shù)量多。經(jīng)T檢驗(yàn)兩組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目有統(tǒng)計(jì)學(xué)

26、差異（t=2.615，P<0.05）。
　　3.比較CD133-和CD133+細(xì)胞在體內(nèi)所建立的肺轉(zhuǎn)移模型對(duì)小鼠生存的影響：CD133-細(xì)胞組小鼠在尾靜脈注射細(xì)胞后第34天、36天分別有1只小鼠出現(xiàn)毫無征兆的死亡，生存率分別為85.71%和71.43%。在第39天有3只小鼠突然出現(xiàn)死亡，最終生存率為28.57%。按照?qǐng)?zhí)行安樂死及實(shí)際死亡小鼠進(jìn)行計(jì)算，CD133+細(xì)胞組在第29天，31天和34天分別有1只小鼠死亡，生存率分別下降為8

27、5.71%，71.43%和57.14%。第39天有3只小鼠死亡，最終生存率為28.57%。應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，Log-rank test方法對(duì)兩組生存情況進(jìn)行比較，得出P>0.05,兩組之間生存的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.CD133-和CD133+細(xì)胞組轉(zhuǎn)移瘤在侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的比較：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)移瘤中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果：p-STAT3在兩組中的表達(dá)有

28、明顯的差別，CD133+細(xì)胞組的相對(duì)表達(dá)量為1.70±0.05，明顯高于CD133-細(xì)胞組（0.83±0.30），經(jīng)T檢驗(yàn)，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.879，P<0.01）。而STAT3在兩組之間的表達(dá)量無明顯差異。侵襲相關(guān)蛋白MMP-9在兩組轉(zhuǎn)移瘤中的相對(duì)表達(dá)量也有明顯的差異， CD133+細(xì)胞組為1.74±0.51，明顯高于CD133-細(xì)胞組（0.47±0.15），兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.168, P<0.05）。

29、另一種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin在兩組之間的相對(duì)表達(dá)水平則與MMP-9相反，CD133+細(xì)胞組為0.86±0.14，明顯低于CD133-細(xì)胞組，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.241，P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.與CD133-細(xì)胞相比，CD133+細(xì)胞更易在體內(nèi)發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，我們推測(cè)CD133+細(xì)胞可能是介導(dǎo)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的主要細(xì)胞。
　　2.CSCs中STAT3的組成性激活可以導(dǎo)致下游侵襲、轉(zhuǎn)移

30、相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá)增高，E-cadherin的表達(dá)降低，使細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。
　　第四部分：DHA對(duì)喉癌CSCs侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的在體實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：檢測(cè)DHA對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制作用，并通過檢測(cè)侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探究可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.將14只BALb/c雄性裸鼠均經(jīng)尾靜脈注射CD133+細(xì)胞建立體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型。將裸鼠隨機(jī)分為2組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組

31、給予DHA（100mg/Kg），對(duì)照組給予DMSO。觀察并記錄小鼠的一般情況以及小鼠的生存時(shí)間。
　　2.對(duì)兩組小鼠的肺組織進(jìn)行HE染色，觀察并計(jì)數(shù)兩組所形成的肺轉(zhuǎn)移灶。
　　3.應(yīng)用Western blot檢測(cè)兩組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶中侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并分析DHA對(duì)小鼠體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移影響的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠的一般情況：對(duì)照組的小鼠分別在第9天、17天、25天，分別有1只小鼠開始出現(xiàn)體重下降

32、，另2只均在第53天開始出現(xiàn)體重下降，其中1只在第59天體重下降了25%。另外1只小鼠雖然體重下降未達(dá)到原體重的20%，但出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、跛行、退縮等反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組有1只小鼠在第23天突然出現(xiàn)體重下降，精神欠佳等。兩組之間體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.DHA可以抑制肺部轉(zhuǎn)移灶的形成：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)比觀察兩組的肺組織，對(duì)照組肺組織顏色蒼白，表面有大量的轉(zhuǎn)移灶，而實(shí)驗(yàn)組肺組織顏色紅潤(rùn)，肺表面轉(zhuǎn)移灶明顯少于對(duì)照組。對(duì)肺組織進(jìn)行HE染色，

33、并對(duì)兩組肺部所形成的轉(zhuǎn)移灶分別進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.940，P<0.05）。
　　3.應(yīng)用DHA后對(duì)小鼠生存的影響：對(duì)照組在第12天、24天、29天分別出現(xiàn)1只小鼠死亡，生存率分別下降為85.71%，71.43%，57.14%。第59天有2只小鼠死亡，最終生存率為28.57%。而實(shí)驗(yàn)組僅在第29天出現(xiàn)1只小鼠死亡，其余小鼠精神狀態(tài)及飲食情況未見明顯變化，均存活至少59+天，總生存率為85.71%。

34、Kaplan-Meier法對(duì)兩組的生存情況進(jìn)行整理分析，并用Log-rank test方法對(duì)兩組的生存進(jìn)行比較，得出實(shí)驗(yàn)組的生存率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　4.DHA的應(yīng)用對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響：我們通過Western blot方法分析兩組肺轉(zhuǎn)移灶侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。P-STAT3在實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量（0.235±0.059）明顯低于對(duì)照組（1.063±0.222）。經(jīng)T檢驗(yàn)，兩組的表達(dá)水平差異明顯（

35、t=6.248，P<0.01）。STAT3在兩組中的表達(dá)量無明顯差異。侵襲相關(guān)蛋白MMP-9在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平為0.300±0.033，明顯低于對(duì)照組（0.926±0.289）。兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.731，P<0.01）。而轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin在加入DHA后的表達(dá)水平為（1.305±0.319），顯著高于對(duì)照組（0.737±0.138）。
　　結(jié)論：
　　1.DHA可以顯著抑制腫瘤在體內(nèi)的侵襲、轉(zhuǎn)