熊果酸經(jīng)ROCK-PPAR-γ-CXCL16信號(hào)通路對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：復(fù)制高氧化程度的氧化型低密度脂蛋白（High ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）損傷病理模型，證明熊果酸（UA）經(jīng)ROCK/PPAR-γ/CXCL16信號(hào)通路保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　方法：以HUVECs為受試對(duì)象，篩選確定High ox-LDL的最佳造模濃度（24h）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為：正常組、High ox-LDL組、UA+High ox-LDL組、ROCK特異性抑制劑（Y27632）組、Y27632+High

2、 ox-LDL組、UA+Y27632+High ox-LDL組、PPAR-γ特異性激活劑（羅格列酮）組、羅格列酮+High ox-LDL組、UA+羅格列酮+High ox-LDL組、PPAR-γ特異性抑制劑（GW9662組）、GW9662+High ox-LDL組、UA+GW9662+High ox-LDL組。采用CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率；應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)不同處理組中ROCK磷酸化水平（p-ROCK/ROCK非磷酸化）以及

3、PPAR-γ、CXCL16在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并運(yùn)用特異性抑制劑/激活劑證明其級(jí)聯(lián)關(guān)系；Amplite ROS Green法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量；并采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：35μg/ml High ox-LDL成功復(fù)制損傷模型，此時(shí)胞內(nèi)ROS是正常組的2.4倍，p-ROCK/ROCK（非磷酸化）比值升高，CXCL16 mRNA表達(dá)上調(diào)，PPAR-γmRNA表達(dá)顯著降低，且PPAR-γ與CXCL16在蛋

4、白水平的表達(dá)與mRNA水平相一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。較之模型組，100μM Y27632(1h)可上調(diào)PPAR-γ在蛋白水平的表達(dá)，100μM Y27632（1h）及100μM羅格列酮（1h）下調(diào)CXCL16蛋白水平以及ROS的含量（P<0.05)，20μM GW9662（30 min)卻使CXCL16和ROS表達(dá)進(jìn)一步升高（P<0.05)，即ROCK/PPAR-γ/CXCL16的激活與 High ox-LDL誘導(dǎo)的氧化

5、損傷呈正相關(guān)。5、10、20μmol/L UA預(yù)孵育16小時(shí)，呈劑量依賴(lài)性提高受損細(xì)胞的存活率（P<0.05），其保護(hù)效果小于Y27632及羅格列酮分別和UA共同作用組（P<0.05)，但可被GW9662拮抗（P<0.05)。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件結(jié)果顯示，UA的不飽和基團(tuán)共價(jià)氧可以與ROCK的活性位點(diǎn)賴(lài)氨酸及酪氨酸殘基通過(guò)氫鍵相結(jié)合。不同濃度的UA均可降低ROCK的磷酸化水平，提高PPAR-γmRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05)，降低C

6、XCL16及胞內(nèi)ROS的生成（P<0.05)。UA+Y27632共孵育能上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，下調(diào)CXCL16及ROS的生成，較模型組有明顯差異（P<0.05)，相對(duì)于分別單用UA及Y27632組卻無(wú)變化（P>0.05）；GW9662拮抗UA對(duì) CXCL16以及 ROS的下調(diào)，使二者生成均升高（P<0.05）；UA可能通過(guò)負(fù)調(diào)控ROCK/PPAR-γ/CXCL16的激活發(fā)揮抗損傷的作用。
　　結(jié)論：35μg/ml的High ox-