攜帶miRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體抗肝癌研究.pdf

1、研究目的：
　　原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人類常見的惡性腫瘤之一，WHO發(fā)表的《全球癌癥報(bào)告2014》指出我國肝癌死亡占全球肝癌死亡人數(shù)的51％。目前肝癌的最佳治療手段仍以手術(shù)為主，但是由于早期發(fā)現(xiàn)與診斷的局限性，僅有15％符合手術(shù)指征。另外，肝癌化療敏感性差、侵襲性強(qiáng)，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率高，5年病死率更是超過90％，因此明確肝癌治療新靶點(diǎn)，探索抗腫瘤或化療增敏的新策略意義重大。近年來mi

2、RNA與腫瘤的關(guān)系日益受到關(guān)注，研究顯示其可對細(xì)胞增殖、分化、凋亡、癌變、激素分泌等諸多生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究通過對肝癌臨床樣本與肝癌細(xì)胞系的分析，篩選出了一系列與肝癌增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA，并嘗試用于肝癌的治療或化療增敏的研究。除此之外，要實(shí)現(xiàn)miRNA的臨床應(yīng)用，安全高效的體內(nèi)運(yùn)載體系開發(fā)亦是重要因素。而外泌體(exosome)作為一類天然脂質(zhì)納米微粒，是體內(nèi)負(fù)責(zé)核酸及蛋白胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的主要介質(zhì)，其在藥物

3、運(yùn)載方面較之傳統(tǒng)病毒載體具有諸多潛在優(yōu)勢。在本研究中，我們首先通過分析肝癌臨床樣本中失調(diào)的miRNA或體外肝癌細(xì)胞系抗腫瘤治療中差異表達(dá)的miRNA，篩選出具有抗腫瘤作用或化療增敏效應(yīng)的miRNA。隨后通過轉(zhuǎn)染miRNA到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose tissue-derived Mesenchymal Stem Cell，AMSC)，并利用其制備大量攜帶這些具有治療性的miRNA的exosome輸注到荷瘤小鼠的腫瘤部位，實(shí)現(xiàn)化療增

4、敏效應(yīng)。
　　第一部分 具有抗肝癌或化療增敏作用的miRNA篩選以及機(jī)制研究
　　本文主要是通過兩方面進(jìn)行具有抗肝癌價(jià)值miRNA的篩選。首先是通過分析從臨床來源的肝癌組織和與其匹配的癌旁組織樣本中差異表達(dá)的miRNA，獲得與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，以及其可能在肝癌化療增敏中的作用和機(jī)制。其次是通過分析一些具有抗肝癌療效藥物的作用機(jī)制，找出其中與抗肝癌密切相關(guān)的miRNA，進(jìn)而研究其在抗肝癌增殖以及化療增敏方面的作用。

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在通過臨床標(biāo)本的分析獲得的差異表達(dá)miRNA中，miR-122通過靶向抑制ADAM10、CCNG1和IGF1R的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對肝癌細(xì)胞的增殖抑制和周期阻滯，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，并可以提高肝癌一線靶向藥物Sorafenib和5-FU的抗腫瘤效果。miR-199*除了可通過靶向抑制mTOR和c-Met的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果外，我們還發(fā)現(xiàn)其可以間接抑制Yap1的表達(dá)而對DNA損傷類藥物的肝癌化療有增敏作用。而在抗腫瘤藥物的機(jī)制研究中篩

6、選得到的miRNA中，發(fā)現(xiàn)miR-34a在槲皮素抗肝癌的作用中發(fā)揮重要作用，其可以通過靶向抑制SIRT1進(jìn)而影響p53的乙?；沟胮53更加穩(wěn)定并促進(jìn)凋亡。在抗腫瘤藥物安奈菲特的衍生物MEAN的抗腫瘤機(jī)制中，我們則發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的miR-141可靶向抑制SPAG9，從而通過JNK通路發(fā)揮抗腫瘤與抗轉(zhuǎn)移作用。最后我們還對四種miRNA在體外細(xì)胞系Huh7中進(jìn)行了5-FU化療增敏評估，顯示四種miRNA都有不錯(cuò)的化療增敏效果，其中miR-1

7、99*化療增敏最明顯，其次是miR-122。
　　第二部分 攜帶治療性miRNA的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)來源的exosome在肝癌治療中的應(yīng)用
　　我們首先從成人脂肪組織中分離培養(yǎng)得到AMSCs，并轉(zhuǎn)染治療性miRNAs(miRNA-122或miR-199*)，培養(yǎng)48h后，從其培養(yǎng)上清中分離得到具有典型表型特征（CD9+、CD63+和CD81+）的exosome(miRNA-Exo)。qPCR分析顯示該exosome

8、中富含上述miRNAs。采用miRNA-Exo單獨(dú)處理肝癌細(xì)胞株或輔以化療藥物，發(fā)現(xiàn)miRNA-Exo處理組肝癌細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞凋亡均顯著增加，并且對化療藥物或靶向藥物的敏感性更高。同時(shí)肝癌細(xì)胞株中miRNA-122或miR-199*的表達(dá)水平顯著升高，而與之對應(yīng)的miRNAs靶基因，如ADAM10、CCNG1、IGF1R、c-Met和Yap1等的表達(dá)水平則明顯降低。顯示攜帶特定治療性miRNAs的exosome可實(shí)現(xiàn)miRNAs向

9、靶細(xì)胞的有效傳遞，進(jìn)而發(fā)揮抗肝癌和化療增敏作用。我們進(jìn)一步在肝癌荷瘤小鼠模型中分析了以exosome作為治療性miRNA運(yùn)載體的可行性。我們在肝癌異位荷瘤小鼠模型中，通過瘤內(nèi)原位注射的方式進(jìn)行miRNA-Exo的輸注，并配合低劑量Sorafenib或5-FU的腹腔注射。藥物治療4周后，miRNA-Exo輸注組的腫瘤體積、腫瘤重量均明顯小于對照組;并且腫瘤組織中miRNA靶基因的表達(dá)亦顯著低于對照組。顯示AMSC來源的exosome可以作

10、為治療性miRNA的理想運(yùn)載體，有效發(fā)揮miRNAs的抗肝癌和化療增敏作用。
　　研究結(jié)論：
　　本研究進(jìn)一步補(bǔ)充了miRNA在肝癌增殖、轉(zhuǎn)移中的作用和調(diào)控機(jī)制。并證實(shí)用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的exosome可作為miRNA的有效運(yùn)載體，實(shí)現(xiàn)特定miRNA向肝癌細(xì)胞的傳遞，通過調(diào)控腫瘤相關(guān)靶基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮miRNA的抗肝癌或化療增敏作用。我們的研究為miRNA的體內(nèi)輸注提供了新方法，為肝癌治療及其化療增敏提供了新思路和新手