酪蛋白肽及其苦味肽功能特性的研究.pdf

1、酪蛋白肽具有多種生物活性而備受關(guān)注，但苦味問題是制約其廣泛應(yīng)用的一個瓶頸。酪蛋白肽的苦味主要是由其所含的一些疏水性氨基酸的肽(苦味肽)導(dǎo)致，目前大多脫苦方法是將苦味肽去除或降解。但一些苦味肽也是生物活性肽，故在研究脫苦方法的同時(shí)，更應(yīng)考慮到其合理利用。本文以Alcalase酶解酪蛋白肽中的苦味肽為主要研究對象，對其疏水性、分子量分布、氨基酸組成及序列等方面進(jìn)行了研究，同時(shí)對水相、醇相酪蛋白肽的功能特性進(jìn)行了比較。在此基礎(chǔ)上，采用復(fù)配酶分

2、步水解工藝制備出低苦味、高水解度的短肽，對其經(jīng)過膜分離的不同分子量肽段組分的功能特性進(jìn)行了研究，以明確各個不同分子量酪蛋白肽組分的主要活性及功能特性，為尋求苦味肽有效、合理的脫除方法及合理應(yīng)用不同分子量酪蛋白肽提供理論依據(jù)。 首先篩選適宜蛋白酶及酶解工藝的優(yōu)化，即分別用龐博木瓜蛋白酶、龐博中性蛋白酶、Neutrase、Alcaltase、Protamex和胰蛋白酶水解酪朊酸鈉，Alcalase酪蛋白肽的三氯乙酸可溶性氮含量和水

3、解度最高且苦味較低。在對Altcaltase水解過程中加酶量、底物濃度、pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的單因素研究基礎(chǔ)上，通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了酪蛋白肽水解度與其中四種影響因素的回歸模型。最終確定Altcaltase酶解酪朊酸鈉的參數(shù)最優(yōu)組合為：水解時(shí)間199min，加酶量4240U/gpro.,pH值10.38，溫度50℃。在此條件下，實(shí)際得到酪蛋白肽的水解度為24.27％，三氯乙酸可溶性氮含量為79.85％，平均肽鏈長度為4.12，平均分

4、子量為471.23，苦味值為2.53。 對異丁醇萃取酪蛋白肽中苦味肽的方法進(jìn)行了優(yōu)化，并分析了不同水解度苦味肽的組成。采用Alcalase在加酶量4240U/gpro.、pH10.38、溫度50℃條件下，制備水解度為10％、15％和20％的酪蛋白肽。對不同條件下異丁醇萃取苦味肽的研究表明，酪蛋白肽濃度為20％、異丁醇添加量為50％、pH自然條件下，能有效萃取出酪蛋白肽中的苦味肽。在此條件下制各了三種水解度的苦味肽CNH-A-1

5、0、CNH-A-15和CNH-A-20。對其分子量分布的研究發(fā)現(xiàn)，它們是一些分子量分布較廣但以小分子為主的肽和少量游離氨基酸的混合物。對其氨基酸組成的研究表明：與源蛋白相比，苦味肽中含有更多的組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸等，必需氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的含量均有所增加；苦味肽的游離氨基酸不足總氨基酸的1％，其中脯氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的含量較高，而甲硫氨酸、賴氨酸等含量較低，必需氨基酸

6、和疏水性氨基酸含量占有較大比例，堿性氨基酸和芳香族氨基酸的含量相對較少。 采用生物質(zhì)譜技術(shù)對CNH-A-10和CNH-A-20進(jìn)行了基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和反相高效液相色譜與電噴霧電離飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(RP-HPLC-ESI-MS)分析。由于樣品組分復(fù)雜且受各種因素的影響，前者結(jié)果不理想。后者由于先分離后分析，得到了較豐富的肽的氨基酸序列信息。RP-HPLC-ESI-MS測定的苦味肽肽段統(tǒng)

7、計(jì)結(jié)果表明：苦味肽基本上是由一些氨基酸殘基數(shù)低于30個、分子量小于4000Da的小肽組成，隨著水解的進(jìn)行，其疏水性氨基酸不斷從肽鏈的中間位置暴露到肽鏈兩端，甚至游離出來，使苦味降低。 對酪蛋白肽、醇相肽和水相肽進(jìn)行了功能特性的比較研究。在Alcalase最適酶解條件下制備了酪蛋白肽，再用異丁醇萃取得到了水相肽、醇相肽。三樣品的RP-HPLC分析表明：酪蛋白肽是親水性與疏水性肽段組成的混合物，水相肽中大部分為親水性強(qiáng)的組分，而醇

8、相肽中主要為疏水性強(qiáng)的組分。對三樣品的理化特性研究表明：在pH2-11的廣泛范圍內(nèi)溶解性都較好，乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性極顯著低于酪朊酸鈉(p＜0.01)。對三樣品的生理活性研究表明：酪蛋白肽對超氧陰離子自由基(O2-)、DPPH·自由基和羥自由基(·OH)均有一定程度的清除作用，在亞油酸體系中也具有抗氧化活力，水相肽對超氧陰離子自由基(O2-)和羥自由基(·OH)的清除率較高，而醇相肽對DPPH自由基的清除及其在亞油酸體

9、系中抗氧化能力較強(qiáng)；三樣品對假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌都有不同程度的抑制作用，水相肽與醇相肽相比，前者對假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和藤黃微球菌的抑制作用較強(qiáng)，而后者對枯草芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)；酪蛋白肽及其水相肽、醇相肽血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性均在80％以上，其中水相肽的抑制率最高；由于具有阿片活性的酪啡肽β-Casomorphin-5和β-Casomorphin-7為平均疏水度較高的

10、小肽，因此大部分存在于醇相萃取的組分中，而水相中含量較少。 在單酶水解基礎(chǔ)上確立了蛋白酶復(fù)配分步水解的工藝，以降低酶解物的苦味值和提高蛋白的水解度。首先用Alcalase對酪朊酸鈉水解，然后從龐博木瓜蛋白酶、龐博中性蛋白、Neutrase和Protamex中選取一種酶對Alcalase酶解物進(jìn)一步水解。木瓜蛋白酶水解物的TCA-SNI和DH最高且苦味最低，故選擇木瓜蛋白酶。據(jù)木瓜蛋白酶水解的單因素及均勻試驗(yàn)的研究結(jié)果確定TCA

11、-SNI最高時(shí)的優(yōu)化組合條件為：加酶量2461U/gpro.,pH5.94，溫度57.4℃。以上條件下獲得的酪蛋白短肽三氯乙酸可溶性氮含量為87.75％，水解度為27.31％，平均肽鏈長度為3.66，平均分子量為420.6，苦味值為1.01。 應(yīng)用膜分離技術(shù)將酪蛋白短肽分離成不同分子量范圍的組分，并研究了各組分的功能特性。先用截留分子量分別為3500Da和1000Da的膜將酪蛋白短肽分離成分子量大于3500Da(A)、小于35

12、00Da大于1000Da(B)和小于1000Da(C)的三個部分。RP-HPLC分析表明，A、B為親水性和疏水性肽的混合物，C在液相色譜上保留時(shí)間較短，主要為親水性的小肽。A、B、C的苦味值均在2以下。A有較好的溶解性，乳化性及乳化穩(wěn)定性高于酪朊酸鈉，而起泡性和泡洙穩(wěn)定性稍低于酪朊酸鈉。B、C均有良好的溶解性，乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性都極顯著低于酪朊酸鈉和A(p＜0.01)。 生理活性研究表明：A、B、C對超氧陰

13、離子自由基(O2-)、DPPH·自由基和羥自由基(·OH)均有一定程度的清除作用，在亞油酸體系中也具有抗氧化活力，其大小依次為B、C、A；A、B、C對假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌和枯草芽孢桿菌都有不同程度的抑制作用，其中對假單胞菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的抑制效果較好；A、B、C對ACE均有一定程度的抑制作用，隨著分子量的減小，ACE抑制活性呈增大趨勢，其中C對ACE的抑制活性最高，為96.01％；A、B、C的βC