Gordona terrae C-6中苯并噻吩脫硫基因的克隆及功能鑒定.pdf

1、油品燃燒時(shí)，其中的硫化物轉(zhuǎn)變成硫氧化物，形成酸雨污染環(huán)境。柴油中含有各種有機(jī)硫化物，其中有些用傳統(tǒng)的物理化學(xué)脫硫方法很難去除，如二苯并噻吩（DBT）、苯并噻吩（BT）及其衍生物。對(duì)生物脫硫（BDS）的研究主要以DBT為模式化合物。相對(duì)來(lái)說(shuō)，對(duì)BT的降解機(jī)理及基因的研究較少。
　　 將DBT脫硫菌株Rhodocossus erythropolis DS-3的dszA、dszB、dszC和dszABC基因分別轉(zhuǎn)入BT脫硫菌株Gord

2、ona terrae C-6中，構(gòu)建了工程菌株G.terrae DRA、G.terrae DRB、G.terrae DRC和G.terrae DRABC。其中G.terrae DRA和G.terraeDRB在以DBT為唯一硫源的培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng)，無(wú)法降解DBT；而G.terraeDRC同表達(dá)完整DBT脫硫酶的G.terrae DRABC一樣，在以DBT為唯一硫源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，亦能降解大部分DBT（84％）。這表明催化BT和DBT

3、前兩步脫硫反應(yīng)的BT單加氧酶和DBT單加氧酶是負(fù)責(zé)底物識(shí)別的關(guān)鍵酶，催化BT和DBT后兩步脫硫反應(yīng)的酶功能相似。Rhodocossus erythropolis DS-3中的DBT脫硫基因與Gordona terrae C-6中的BT脫硫基因具有較高的同源性。
　　 應(yīng)用兼并PCR技術(shù)等方法從戈登氏菌Gordona terrae C-6中克隆了BT脫硫酶基因bdsA、bdsB和bdsC。其中，bdsA與dszA的同源性為99％（

4、1363/1366）；bdsB與dszB的同源性為99％（1092/1098）；bdsC與dszC的同源性為98％（1239/1254）。BdsA、BdsB和BdsC的模擬三維結(jié)構(gòu)分析表明，BdsA與DszA、BdsB與DszB的三維結(jié)構(gòu)基本一致，其功能可能相似。BdsC與DszC的三維結(jié)構(gòu)有一定的差別，它可能是整個(gè)途徑中用于識(shí)別底物的關(guān)鍵酶。
　　 將bdsABC分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，BdsA、BdsB和BdsC分子量分

5、別為48kD、38kD和45kD與氨基酸分析結(jié)果一致。在大腸桿菌中共表達(dá)dszX和bds（ABC-x）（X=A、或B、或C、或AB、或BC、或AC、或ABC）以檢測(cè)相應(yīng)酶在功能上的互補(bǔ)性。結(jié)果同樣證明了BdsA與DszA、BdsB與DszB的功能可能相似。BdsC與DszC可能是整個(gè)途徑中用于識(shí)別底物的關(guān)鍵酶。
　　 利用紅球菌-大腸桿菌穿梭載體pRHK1將BT降解菌Gordona terrae C-6的脫硫基因bdsA、bds

6、B、bdsC和bdsABC分別轉(zhuǎn)入DBT降解菌R.erythropolis DS-3中，構(gòu)建了工程菌株R.erythropolis CRA、R.erythropolis CRB、R.erythropolis CRC和R.erythropolis CRABC。其中，R.erythropolis CRC和R.erythropolis CRABC能以BT為硫源生長(zhǎng)，其他菌株無(wú)法利用BT。在抗生素的選擇壓力下，傳代10次后重組質(zhì)粒pRCC仍能在