哈茨木霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、幾丁質(zhì)及其水解產(chǎn)物在病蟲害防治、醫(yī)藥生產(chǎn)和飼料加工等多個領(lǐng)域具有廣泛的用途，其專一性水解酶——幾丁質(zhì)酶(chitinase)已成為當前研究的熱點，分離新的幾丁質(zhì)酶基因、構(gòu)建高效表達工程菌，對實現(xiàn)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。
　　本文通過對哈茨木霉進行誘導(dǎo)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定其酶活性，發(fā)現(xiàn)有1株菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較強。根據(jù)GenBank中多種真菌幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的保守區(qū)設(shè)計特異性兼并引物，利用RT-PCR

2、和3’/5’RACE技術(shù)從高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株—哈茨木霉中克隆出完整的幾丁質(zhì)酶基因。該基因cDNA全長1517bp，5’端和3’端非翻譯區(qū)長度分別為47bp和177bp，開放閱讀框為1293bp；以哈茨木霉基因組DNA為模版，通過PCR擴增發(fā)現(xiàn)含有3個內(nèi)含子。編碼430個氨基酸，信號肽長度為22個氨基酸。其對應(yīng)的氨基酸序列具有幾丁質(zhì)酶18家族的2個高度保守的活性區(qū)域：幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域SXGG和酶作用活性位點DXXDXDXE。
　　構(gòu)建幾

3、丁質(zhì)酶基因高效表達真核載體pPIC9K-Thchit44，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115中進行表達，培養(yǎng)液中幾丁質(zhì)酶的活力可達58.6U/ml，較哈茨木霉幾丁質(zhì)酶活力（23.5U/ml）提高2.49倍。經(jīng)SDS-PAGE獲得44kD重組目的蛋白，與理論預(yù)測值一致。
　　綜上所述，本文已成功地從哈茨木霉中分離出幾丁質(zhì)酶Thchit44基因，并構(gòu)建了高效真核表達載體pPIC9K-Thchit44，同時優(yōu)化了