酶膜生物反應(yīng)器制備核苷酸的研究.pdf

1、5’-核苷酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及食品行業(yè)，在世界范圍內(nèi)核苷酸類藥品、制劑成為研究和投資的熱點(diǎn)之一，需求量日益增長(zhǎng)。國內(nèi)僅個(gè)別廠家能進(jìn)行四種核苷酸生產(chǎn)，且產(chǎn)品純度不高，產(chǎn)量不大，原料不足的問題嚴(yán)重制約了我國核苷酸類藥物和衍生物的開發(fā)。酶膜生物反應(yīng)器是在生物化工和膜分離技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型反應(yīng)器，作為生物反應(yīng)分離耦合過程的一個(gè)具體應(yīng)用，其有不可比擬的優(yōu)越性，在食品、生物化工、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。為此本課題開展了酶膜生物

2、反應(yīng)器制備核苷酸的研究。主要研究了核酸酶P1的制備及分離純化、游離及固定化酶膜生物反應(yīng)器制備核苷酸、核苷酸的分離純化等。 利用正交及響應(yīng)面法優(yōu)化了培養(yǎng)基成分，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，可得到核酸酶P1最大酶活性354 U/ml。通過熱失活、超濾、硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水作用層析、離子交換層析以及凝膠層析等生化分離手段提純得到了電泳純核酸酶P1，酶蛋白比活為1264U/mg，純化倍數(shù)為93.4。研究了核酸酶P1酶學(xué)性質(zhì)，得

3、到了pH穩(wěn)定性范圍為4-O-7-O，最適pH為5.4；最適溫度為69℃；Al<'3+>、Cu<'2+>、Co<'2+>、SDS對(duì)核酸酶P1有明顯的抑制作用，Zn<'2+>、K<'+>對(duì)核酸酶P1有明顯的激活作用；米氏常數(shù)K<,m>為24.28 mg/ml。 研究了游離酶膜通量衰減曲線，考察了溫度、壓力等對(duì)膜通量的影響，優(yōu)化了游離酶膜生物反應(yīng)器的操作條件，并通過單因素及曲面響應(yīng)法確定了游離酶膜生物反應(yīng)器制備核苷酸的最佳酶解工藝條件

4、：底物濃度1.25％、鋅離子濃度6.0×10<'4> mol/l、底物pH為5.3、加酶量0.080 mg/ml、溫度為65℃、底物中醋酸緩沖液的濃度0.125 mol/l。在最佳條件下制備的核苷酸收率為12.15 mg/ml，平均轉(zhuǎn)化率為97.2％。 考察了紙纖維為載體的共價(jià)偶聯(lián)法、殼聚糖微球和DEAE纖維素為載體的交聯(lián)法等幾種固定化方法，獲得較優(yōu)的固定化條件。研究了固定化核酸酶P1的酶學(xué)性質(zhì)，與游離酶相比：最適pH提高0.5

5、個(gè)單位，耐酸堿性也得到了提高；以殼聚糖微球和紙纖維為載體的固定化酶最適溫度提高了10℃，熱穩(wěn)定性、存儲(chǔ)穩(wěn)定性都得到了提高；紙纖維固定化酶、殼聚糖微球固定化酶、DEAE纖維素固定化酶的米氏常數(shù)K<,m>分別為5.72、96.58、27.21 mg/ml。 采用化學(xué)交聯(lián)法和物理吸附法研究了以膜為載體的酶固定化方法，結(jié)果表明化學(xué)交聯(lián)法優(yōu)于物理吸附法。同時(shí)考察了上述幾種固定化酶在膜生物反應(yīng)器里的使用穩(wěn)定性，相比較而言殼聚糖微球固定化酶比

6、較適合，使用十次后殘留相對(duì)酶活為96％，核苷酸轉(zhuǎn)化率為84％。通過單因素及曲面響應(yīng)法確定了殼聚糖微球固定化酶在膜生物反應(yīng)器中制備核苷酸的最佳酶解工藝條件：底物濃度1.57％、鋅離子濃度6.0×10<'-4>mol/l、底物pH為5.4、加酶量0.080 mg/ml、溫度為72℃、底物中醋酸緩沖液的濃度0.125 mol/l。在最佳酶解工藝條件下可得到最大核苷酸收率為14.52 mg/ml，轉(zhuǎn)化率為92.5％。 對(duì)酶解產(chǎn)物5’-核