基質(zhì)金屬蛋白酶12表達(dá)對(duì)糖尿病腎病及高脂腎損傷的腎保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、隨著世界經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人們生活水平的普遍升高，飲食結(jié)構(gòu)中高糖、高脂成分所占比率逐年提高，致使人類糖尿病及高脂血癥的發(fā)病率逐年增加。我國作為世界上最大的糖尿病流行地，超過1.3億的糖尿病患者給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）作為糖尿病患者主要微血管并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為終末期腎?。╡nd stage renal disease, ESRD）的重要病因，與糖尿病患者的死亡率密切相關(guān)。同

2、時(shí)脂代謝紊亂如高脂血癥，也是糖尿病腎病的重要危險(xiǎn)因素，增高的血脂可以直接沉積在腎臟中造成腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞等損傷，加重腎小球硬化。因此糖尿病腎病以及高脂血癥伴隨血糖升高、血脂異常可引起一系列腎臟病理改變，包括細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）聚集、氧化應(yīng)激、炎細(xì)胞浸潤等，加重腎臟纖維化（renal fibrosis）。腎臟纖維化又是所有慢性腎?。╟hronic kidney disease, CKD）

3、發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路。目前認(rèn)為腎臟纖維化是一個(gè)類似于損傷的愈合反應(yīng)過程。在炎癥損傷反應(yīng)過程中，腎臟內(nèi)出現(xiàn)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤和 T細(xì)胞激活，活性氧（reactive oxygen species, ROS）產(chǎn)生增多，炎細(xì)胞及促炎細(xì)胞趨化因子分泌增加，上述病理改變又通過激活腎臟系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞分泌大量的ECM組分，逐漸加重腎臟纖維化，最終發(fā)展至終末期腎衰竭，而使正常腎功能永久喪失。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶-

4、12（matrix metalloproteinase-12, MMP-12），又稱為巨噬細(xì)胞金屬蛋白酶，最早是在巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種能夠降解彈性蛋白（elastin）的金屬蛋白酶。研究表明，MMP-12不僅可以降解其主要底物-彈性蛋白，而且同樣可以降解其它一些ECM組分，如IV型膠原、纖維連接蛋白（fibronectin, FN）、層粘連蛋白（laminin, LN）、Vitronectin、蛋白多糖、硫酸軟骨素和髓磷脂堿性蛋白等。目

5、前已知 MMP-12可在肥厚性破骨細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、活化的腎系膜細(xì)胞和一些癌癥細(xì)胞表達(dá)。MMP-12表達(dá)異常與腹主動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈粥樣硬化和肺氣腫等疾病密切相關(guān)，但是 MMP-12的表達(dá)對(duì)于糖尿病腎病和高脂腎損傷中所產(chǎn)生的相關(guān)病理機(jī)制還鮮有報(bào)道。
　　目的：通過對(duì)體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠腎小球系膜細(xì)胞以及DN、高脂腎損傷動(dòng)物模型進(jìn)行研究，觀察 MMP-12基因表達(dá)缺失在 DN和高脂腎損傷中細(xì)胞外基質(zhì)、氧化應(yīng)激、炎細(xì)胞浸潤等方面發(fā)揮的腎

6、保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　本研究利用體外培養(yǎng)的 SD大鼠腎小球系膜細(xì)胞（ glomerular mesangial cell, GMC），觀察高糖對(duì)GMC中MMP-12基因、大鼠GMC中ECM和氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，并通過 siRNA敲低MMP-12基因的表達(dá)，觀察MMP-12基因表達(dá)降低后對(duì)與腎臟纖維化密切相關(guān)的TGF-β1信號(hào)途徑的影響。為闡明MMP-12的在DN中的相關(guān)機(jī)制，利用MMP-12基因敲

7、除小鼠構(gòu)建鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎病動(dòng)物模型，探討MMP-12基因表達(dá)缺失在DN中的腎保護(hù)作用。利用載脂蛋白E（apolipoprotein E, apo E）和MMP-12雙基因敲除小鼠構(gòu)建高脂飲食（high fat diet, HFD）誘導(dǎo)的小鼠高脂腎損傷動(dòng)物模型，探討MMP-12基因表達(dá)缺失在高脂腎損傷中的腎保護(hù)作用。并同時(shí)應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR（Real Time-qPCR）、West

8、ern blot檢測ECM、氧化應(yīng)激和炎細(xì)胞浸潤相關(guān)基因 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)變化；應(yīng)用免疫熒光染色確定相關(guān)蛋白的相互作用；應(yīng)用免疫組化染色觀察腎臟組織中ECM聚集、氧化應(yīng)激、炎細(xì)胞浸潤這三方面病理改變，最終闡明 MMP-12基因表達(dá)缺失在糖尿病腎病小鼠模型和HFD誘導(dǎo)腎損傷小鼠動(dòng)物模型中發(fā)揮的腎保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1 MMP-12對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠GMC中ECM表達(dá)和氧化應(yīng)激的影響
　　1.1 SD大鼠

9、腎小球系膜細(xì)胞分離和培養(yǎng)：SD大鼠GMC體外傳代培養(yǎng)后分為三組，即正常對(duì)照組（D-葡萄糖5.5mmol/L，NG組）、甘露醇組（甘露醇25mmol/L，MG組）、高糖組（D-葡萄糖30 mmol/L，HG組）。分別于處理后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取蛋白和總RNA，Western blot和Real Time-qPCR分析MMP-2、MMP-9、MMP-12、TGF-β、FN、LN等主要的ECM、氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化；通過si

10、RNA敲低MMP-12基因的表達(dá)觀察其對(duì)腎臟纖維化密切相關(guān)的TGF-β1信號(hào)途徑的影響。
　　1.2高糖誘導(dǎo)SD大鼠腎小球GMC上調(diào)ECM相關(guān)基因的表達(dá)：Real time qPCR的結(jié)果表明，與NG組相比，HG處理后GMC中的MMP-2、MMP-9、MMP-12、FN和 LN基因的表達(dá)均上調(diào)，其中 MMP-2、MMP-9、FN和LN基因的表達(dá)于6-12 h開始升高，呈時(shí)間依賴性，MMP-2到48 h時(shí)達(dá)到峰值，72 h后表達(dá)略有

11、下降，但仍高于NG組和MG組其他各時(shí)間觀察點(diǎn)（P<0.05）；MMP-9到24 h時(shí)達(dá)到峰值，48h、72 h后表達(dá)略有下降，但仍高于NG組和MG組其他各時(shí)間觀察點(diǎn)（P<0.05）；FN和LN到72 h時(shí)達(dá)到峰值；而MMP-12基因的表達(dá)于6 h開始升高，呈時(shí)間依賴性，到12 h時(shí)達(dá)到峰值（P<0.05），一直持續(xù)高表達(dá)至48h，72 h后表達(dá)略有下降，但仍高于NG組和MG組其他各時(shí)間觀察點(diǎn)（P<0.05）。
　　1.3高糖誘導(dǎo)G

12、MC上調(diào)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示，高糖能夠誘導(dǎo)GMC表達(dá)不同類型的NADPH氧化酶（Nox），與NG組相比，HG處理后Nox2、Nox4以及亞基p67phox和p22phox的表達(dá)在48 h后達(dá)到峰值，72 h后其表達(dá)仍然高于同一時(shí)間點(diǎn) NG組和 MG組細(xì)胞（P<0.05）。
　　1.4敲低MMP-12基因的表達(dá)顯著抑制TGF-β1的信號(hào)途徑：Western blot結(jié)果顯示，GMC經(jīng) HG刺激后不

13、僅顯著上調(diào) TGF-?1的表達(dá)，而且促使TGF-β1（4 ng/mL，10 min）誘導(dǎo)的ERK1/2和Akt磷酸化增強(qiáng)。而siRNA敲低GMC中MMP-12基因的表達(dá)，則能夠顯著抑制HG上調(diào)的TGF-β1表達(dá)及其增強(qiáng)ERK1/2和Akt磷酸化的作用。
　　2 MMP-12基因表達(dá)缺失在糖尿病腎病小鼠模型中發(fā)揮腎保護(hù)作用
　　2.1 WT組小鼠和MMP-12-/-組小鼠生化指標(biāo)和腎功能指標(biāo)的變化：MMP-12基因敲除小鼠和相

14、同遺傳背景的 C57BL/6J（WT）小鼠腹腔一次性注射STZ（175 mg/kg）制備DN動(dòng)物模型，造模成功后八周檢測小鼠生化指標(biāo)和腎功能指標(biāo)的變化。WT組小鼠和MMP-12-/-組小鼠無論是對(duì)照組（NC）還是糖尿病腎病組（DN）體重和血壓無顯著差異，但是 DN組的血糖水平顯著高于NC組（WT組，DN小鼠288.4±14.3 vs NC128.6±13.6, P<0.05；MMP-12-/-組，DN小鼠245.3±11.7 vs NC

15、134.9±14.1, P<0.05），該結(jié)果表明， MMP-12基因敲除能夠顯著抑制 STZ誘導(dǎo)血糖升高（MMP-12-/-組，DN245.3±11.7 vs WT DN288.4±14.3，P<0.05）。DN組同NC組相比，24小時(shí)尿白蛋白排泄（albumin excretion，μg/24 h）、血肌酐（SCR）和尿素氮（BUN）顯著升高（P<0.05），表明此時(shí)糖尿病腎臟病變加重，腎功能受損，但是MMP-12-/-組中DN小鼠

16、同WT組中DN小鼠相比，24小時(shí)尿白蛋白排泄、SCR和 BUN水平有顯著降低，表明MMP-12表達(dá)缺失能夠部分逆轉(zhuǎn)STZ誘導(dǎo)的腎損傷，對(duì)DN產(chǎn)生一定的腎保護(hù)作用。
　　2.2 MMP-12的表達(dá)與腎損傷程度密切相關(guān)：PAS染色結(jié)果表明，STZ誘導(dǎo)8周后，WT組中DN小鼠腎小球體積顯著增大、系膜基質(zhì)增多、基底膜增厚。MMP-12-/-組中DN小鼠同WT組DN小鼠相比，腎臟病變程度明顯減弱。同時(shí)免疫組化染色結(jié)果顯示，WT組中 DN小鼠

17、腎小球部位MMP-12陽性染色顆粒明顯增多，表明MMP-12的表達(dá)和腎小球病變程度具有正相關(guān)性。
　　2.3 MMP-12缺失抑制STZ誘導(dǎo)腎小球細(xì)胞外基質(zhì)聚集和促炎相關(guān)基因的表達(dá)：Real time qPCR結(jié)果顯示，MMP-12-/-組DN小鼠腎組織中MMP-12、MMP-2和 MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄水平較 WT組 DN小鼠表達(dá)顯著降低；MMP-12-/-組DN小鼠腎組織中TGF-β1及其下游FN和LN等纖維化相關(guān)基因表達(dá)均較W

18、T組的DN小鼠顯著下調(diào)；MMP-12基因缺失同時(shí)抑制了腎小球單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子單核細(xì)胞趨化因子-1（ monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和CD11b的表達(dá)。
　　2.4 MMP-12缺失逆轉(zhuǎn)在腎小球STZ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤：免疫組化結(jié)果表明，與WT組NC小鼠相比，WT組DN小鼠腎小球區(qū)域能檢測到較強(qiáng)的CD68陽性染色顆粒，而在MMP-12-/-組DN小鼠腎小球中CD68的表達(dá)卻顯著低

19、于WT組DN小鼠，Real time qPCR結(jié)果也同時(shí)證實(shí)了CD68轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平具有相同的變化趨勢(shì)。
　　2.5 MMP-12缺失抑制STZ誘導(dǎo)的腎小球氧化應(yīng)激：Western blot結(jié)果表明WT組中，STZ誘導(dǎo)DN小鼠腎小球中Nox4和p67phox表達(dá)顯著增加，而MMP-12表達(dá)缺失能夠顯著降低腎小球中Nox4和p67phox的表達(dá)。STZ的誘導(dǎo)作用通常是通過激活上游的 MCP-1和 TGF-β的表達(dá)來完成的。同WT

20、組對(duì)照小鼠相比，STZ誘導(dǎo)WT組DN小鼠腎小球中MCP-1和TGF-β的表達(dá)及其下游信號(hào)分子ERK1/2和Akt的磷酸化顯著增加，而MMP-12表達(dá)缺失能夠逆轉(zhuǎn) STZ對(duì)這兩種促氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)和下游信號(hào)分子的磷酸化的促進(jìn)作用。
　　3 MMP-12基因表達(dá)缺失在高脂腎損傷小鼠模型中發(fā)揮腎保護(hù)作用
　　3.1 MMP-12缺失逆轉(zhuǎn) HFD誘導(dǎo)的腎損傷：HFD飼養(yǎng) apo E?/?和 apo E?/?MMP-12?/?小鼠不

21、同時(shí)間點(diǎn)后生化指標(biāo)顯示， apo E?/?和 apo E?/?MMP-12?/?小鼠的體重、血壓、總膽固醇、甘油三酯、HDL和 LDL水平在各組無明顯差異。同正常飲食小鼠相比，反映腎功能指標(biāo)的24小時(shí)尿蛋白定量和血清肌酐濃度在HFD后第6和第9個(gè)月顯著增高，但是apo E?/?MMP-12?/?小鼠 HFD組這兩個(gè)指標(biāo)顯著低于同時(shí)間點(diǎn) HFD組的 apo E?/?相小鼠，該結(jié)果表明 MMP-12缺失能夠部分逆轉(zhuǎn) HFD誘導(dǎo)的腎臟損傷。<

22、br>　　3.2 HFD誘導(dǎo)腎小球MMP-12的表達(dá)：免疫組化和Real-time qPCR結(jié)果顯示，在HFD誘導(dǎo)的apo E?/?小鼠中，MMP-12陽性染色顆粒隨HFD處理時(shí)間的延長呈持續(xù)增多的趨勢(shì)；腎小球MMP-12 mRNA水平通過qRT-PCR進(jìn)行分析，結(jié)果顯示了相同的變化趨勢(shì)。
　　3.3 MMP-12缺失抑制HFD誘導(dǎo)的腎小球胞外基質(zhì)聚集和促炎相關(guān)基因的表達(dá)：免疫組化和Real-time qPCR技術(shù)顯示，HFD能夠

23、誘導(dǎo)apo E?/?小鼠FN和IV型膠原在腎組織的持續(xù)表達(dá)，而MMP-12缺失則可逆轉(zhuǎn)HFD誘導(dǎo)的FN和IV型膠原的表達(dá)上調(diào)過程；Real-time qPCR結(jié)果表明，HFD處理3個(gè)月后 apo E?/?小鼠腎臟纖維化標(biāo)記基因 TGF-β1，炎癥相關(guān)基因MCP-1和CD11b的mRNA水平顯著增加，而apo E?/?MMP-12?/?小鼠腎小球中這兩類基因的mRNA水平顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的apo E?/?小鼠；
　　3.4 MMP-

24、12缺失逆轉(zhuǎn)HFD誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在腎小球的募集和浸潤：免疫組化和Real-time qPCR結(jié)果顯示， apo E?/?小鼠腎小球巨噬細(xì)胞募集和浸潤在HFD處理后3、6、9個(gè)月持續(xù)表達(dá)增強(qiáng)，而MMP-12缺失可以抑制HFD誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在腎小球的募集和浸潤。3D膠細(xì)胞體外侵染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，MMP-12缺失能夠拮抗或抑制HFD誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞募集和浸潤過程。免疫熒光染色后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示腎小球MMP-12是由募集和浸潤的

25、巨噬細(xì)胞分泌或是由損傷導(dǎo)致的活化系膜細(xì)胞分泌。
　　3.5 MMP-12缺失抑制HFD誘導(dǎo)的腎小球氧化應(yīng)激過程：Western blot結(jié)果顯示HFD能夠誘導(dǎo)apo E?/?小鼠Nox4和p67phox的持續(xù)表達(dá)，而MMP-12缺失則逆轉(zhuǎn)HFD誘導(dǎo)的Nox4和p67phox的表達(dá)上調(diào)過程。對(duì)其信號(hào)途徑的研究表明，HFD誘導(dǎo)的apo E?/?小鼠腎小球中ERK1/2和Akt的磷酸化水平在3-6個(gè)月時(shí)顯著增強(qiáng)，但這種影響可在MMP-1

26、2表達(dá)缺失時(shí)而被顯著抑制。
　　結(jié)論：
　　1高糖可以誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞中MMP-12、細(xì)胞外基質(zhì)組分、促炎因子及氧化應(yīng)激等相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)；
　　2敲低 MMP-12基因的表達(dá)顯著抑制與腎臟纖維化密切相關(guān)的TGF-?1的信號(hào)途徑；
　　3 MMP-12基因表達(dá)缺失可以通過降低FN、LN、IV型膠原減少細(xì)胞外基質(zhì)聚集，通過減少NADPH氧化酶表達(dá)抑制氧化應(yīng)激，通過降低促炎因子表達(dá)抑制炎細(xì)胞浸潤，進(jìn)而在 STZ誘