第一部分ATF6對(duì)肝癌細(xì)胞系活性影響的研究第二部分HBV對(duì)thapsigargin引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)影響的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 ATF6對(duì)肝癌細(xì)胞系活性影響的研究
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)控蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊修飾的重要細(xì)胞器，然而，在一些理化因素的作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境常常發(fā)生巨大變化，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄活化因子ATF6是未折疊蛋白反應(yīng)中的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，其分子大小為90kDa，可促進(jìn)分子伴侶表達(dá)，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊能力。近來有研究顯示腫瘤細(xì)胞由于其特殊的內(nèi)外環(huán)境，常常伴隨著

2、未折疊蛋白反應(yīng)的發(fā)生，且ATF6作為重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系，但其對(duì)肝細(xì)胞肝癌的作用卻鮮有報(bào)道。
　　研究目的:在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)ATF6基因，鑒定ATF6對(duì)肝癌細(xì)胞活性、遷移、侵襲及克隆形成能力的影響。
　　研究方法:采用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的p3 X-Flag-CMV-14-ATF6真核表達(dá)質(zhì)粒，分別對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC7721進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以上調(diào)ATF6基因的表達(dá)水平，同時(shí)以未經(jīng)處理和轉(zhuǎn)染

3、p3X-Flag-CMV-14空載質(zhì)粒的細(xì)胞作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照。通過MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)等，探究ATF6對(duì)肝癌細(xì)胞系的影響。
　　研究結(jié)果:在HepG2及SMMC7721細(xì)胞系中分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ATF6真核表達(dá)質(zhì)粒后，qPCR檢測(cè)，ATF6的mRNA表達(dá)水平顯著升高。MTT細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)ATF6基因表達(dá)水平后，兩種細(xì)胞系的細(xì)胞活性與陰性對(duì)照組相比無明顯改變。劃

4、痕實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)ATF6基因表達(dá)水平可使兩種細(xì)胞系的遷移距離增加。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)兩種細(xì)胞系的ATF6基因表達(dá)水平顯著增加了Transwell下室面的細(xì)胞數(shù)量。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，ATF6的過表達(dá)同樣顯著增加了Transwell下室面上兩種細(xì)胞的數(shù)量?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)中，提高ATF6基因表達(dá)水平可提高兩種細(xì)胞系克隆形成集落的數(shù)量。
　　研究結(jié)論:在肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC7721中，提高ATF6的表達(dá)水

5、平，均可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲及克隆形成能力，而對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響。
　　第二部分 HBV對(duì)thapsigargin引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)影響的研究
　　毒胡蘿卜素是一種潛在的抗腫瘤藥物，它可以通過對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣泵的抑制而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而有效的引發(fā)細(xì)胞凋亡。肝細(xì)胞肝癌在世界范圍內(nèi)屬于第六大癌癥，是造成腫瘤相關(guān)死亡的第三大因素。而在中國(guó)，乙肝病毒感染是造成肝癌產(chǎn)生的主要原因。
　　研究目的:利用乙肝病毒呈陽性的H

6、epG2.2.15和乙肝病毒呈陰性的HepG2的兩種肝癌細(xì)胞系，探究乙肝病毒在毒胡蘿卜素引發(fā)的凋亡中的作用。
　　研究方法:首先在HepG2.2.15和HepG2中細(xì)胞分別加入毒胡蘿卜素，顯微鏡觀察0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。繼而通過MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)確定兩種肝癌細(xì)胞系經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡情況。通過qPCR檢測(cè)兩種細(xì)胞在經(jīng)過毒胡蘿卜素處理后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路中相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，確定了主要作用基因CHOP，并通過Western blotting檢測(cè)CHOP蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。此外，我們用干擾素IFNα處理HepG2.2.15細(xì)胞后檢測(cè)乙肝病毒被抑制時(shí)細(xì)胞凋亡情況及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中主要基因表達(dá)量的變化，最后我們分別在HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞中提高和敲低CHOP基因的表達(dá)量，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種細(xì)胞系凋亡狀態(tài)發(fā)生的變化。
　　研究結(jié)果:毒胡蘿卜素處理后顯

8、微鏡觀察細(xì)胞顯示HepG2.2.15比HepG2細(xì)胞有著更好的細(xì)胞形態(tài)。通過MTT細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)與流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)在毒胡蘿卜素處理后，乙肝病毒呈陰性的HepG2細(xì)胞比乙肝病毒呈陽性的HepG2.2.15細(xì)胞有更高的凋亡水平。此外，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，HepG2細(xì)胞中G2期細(xì)胞所占的比例高于HepG2.2.15細(xì)胞。qPCR對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因的檢測(cè)分析，確定CHOP為主要變化基因，通過Western blotti