光合產(chǎn)氫細(xì)菌PB-a的分離鑒定、產(chǎn)氫特性和產(chǎn)氫系統(tǒng)群落分析.pdf

1、本文以光合細(xì)菌產(chǎn)氫為研究對象,對其在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上作了初步的理論研究,主要結(jié)論如下： 1.從豬糞發(fā)酵活性污泥中分離得到1株高效產(chǎn)氫菌株P(guān)B-a。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第9版,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析,與紅假單胞菌相符合?；?6S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,菌株P(guān)B-a和Rhodopseudomonas palustris S55聚為一個分支,兩者遺傳距離非常近。通過同源性序列多重比對和進(jìn)化樹分析結(jié)果確定該菌株歸于沼澤

2、紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。 2.以篩選得到的高效產(chǎn)氫菌PB-a(沼澤紅假單胞菌)為研究對象,較系統(tǒng)地探討了pH、溫度以及光照強(qiáng)度等環(huán)境條件、微量元素、氮源、碳源以及其它礦質(zhì)元素對PB-a菌株的生長、產(chǎn)氫過程的影響,并運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)方法對PB-a的產(chǎn)氫培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,得出了最適宜其生長和產(chǎn)氫的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基各元素單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析顯示,除CaCl2外,其它所有成分均對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生顯著

3、性影響。正交實(shí)驗(yàn)得出,最適宜PB-a菌株產(chǎn)氫的培養(yǎng)基組成為(g/L)：乙酸鈉40 mmol/L,谷氨酸鈉15 mmol/L,MgSO4 0.3,NaCl 0.4,KH2PO4 0.2,K2HPO4 0.6,NaHCO3 0.756,微量元素溶液1 mL。微量元素影響的正交試驗(yàn)結(jié)果表明,Fe、Mo、Mn和Ni 4種元素對PB-a菌株光合產(chǎn)氫的效果有顯著影響,依次為Fe>Mo>Mn>Ni。其他元素在所設(shè)范圍內(nèi)對產(chǎn)氫都有一定的促進(jìn)作用,因此微

4、量元素溶液配方仍為(g/L)：FeSO4·7H2O 2,ZnCl2 0.1,MnCl2·4H2O 0.1,H3BO4 0.1,COCl2·6H2O 0.1,NiCl2·6H2O 0.02,Na2MoO4·2H2O 0.75,CuCl2·2H2O 0.01。對影響PB-a生長以及產(chǎn)氫環(huán)境條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,光強(qiáng)4000 lux、初始pH 7、溫度30℃最適宜該菌株的產(chǎn)氫。綜合各個因素的最佳條件,PB-a菌株在100 mL培養(yǎng)體積中,最高可

5、產(chǎn)氫總量為140.33 mL,最大平均產(chǎn)氫速率達(dá)20.9 ml/h/g(cdw),最高產(chǎn)氫速率為30 ml/h/g(cdw),底物最大轉(zhuǎn)化率為38.9％。 3.研究了菌株P(guān)B-a在產(chǎn)氫過程中固氮酶、吸氫酶活性和放氫活性的變化。結(jié)果表明,固氮酶活性和菌株放氫活性變化趨勢相一致,在第3至4 d的快速產(chǎn)氫期,活性驟然升高,之后開始緩慢下降,維持一段時間后,固氮酶活性保持在很低水平,而放氫活性基本消失。 而氫酶的吸氫活性表現(xiàn)為隨

6、著時間推移,慢慢呈上升趨勢。綜合這三者的活性變化,基本與整個反應(yīng)體系中總產(chǎn)氫歷程和產(chǎn)氫量的變化相符合。對菌株P(guān)B-a產(chǎn)氫過程中的細(xì)胞全蛋白作了SDS-PAGE分析,展示了其在時序上的表達(dá)情況,結(jié)果顯示其在組成和量的表達(dá)差異上變化不大。微量元素Fe、Mo和Ni是固氮酶和氫酶的組成元素,因此對菌株的產(chǎn)氫影響較大。通過對不同元素缺乏情況下細(xì)胞全蛋白分析表明,蛋白在不同培養(yǎng)條件下,表達(dá)組分和表達(dá)量都有明顯差異,為以后研究產(chǎn)氫工程菌提供了一定的基

7、礎(chǔ)。 4.利用DGGE技術(shù)監(jiān)測混合光合產(chǎn)氫反應(yīng)器中群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。V3-16S rDNA的DGGE圖譜反映了產(chǎn)氫系統(tǒng)中總體群落結(jié)構(gòu)不同時段的多樣性變化。從圖譜分析可見,總體菌群在數(shù)量上變化不大,但是在組成上卻發(fā)生了很大的變化,圖譜中始終存在、并保持相當(dāng)強(qiáng)度的條帶代表了產(chǎn)氫主體—光合細(xì)菌。pufM基因的DGGE圖譜反應(yīng)了產(chǎn)氫系統(tǒng)中無氧光合細(xì)菌多樣性的動態(tài)變化。兩者的圖譜比較分析顯示,后者較前者顯示的群落多樣性更為復(fù)雜,表現(xiàn)為條