黑腹果蠅Drs基因家族的轉(zhuǎn)錄活性及調(diào)控特征的研究.pdf

1、當昆蟲受到微生物感染后，體內(nèi)會被誘導產(chǎn)生一系列的小分子活性多肽--抗微生物肽(AMPs)。在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中，目前已發(fā)現(xiàn)鑒定的AMPs有7種。其中Drosomycin等4種AMPs存在數(shù)目不等的同系物(isoforms)基因成員，構成該種AMPs的“多基因家族”(multigenefamily)(簡稱“基因家族”)。
　　 黑腹果蠅的Drosomycin(Drs)是第一個從昆蟲中鑒定的

2、抗真菌肽(AFP)，它只對絲狀真菌有抗菌活性，而對細菌和酵母沒有活性。在黑腹果蠅基因組中，有1個成員Drs、Drs-lD、Drs-lE、Drs-lF、Drs-lG、Drs-lC和Drs-lI共同構成Drs基因家族。前期研究表明黑腹果蠅的Drs基因家族成員之間存在明顯的抗真菌活性差異，其中Drs的抗菌譜最廣，Drs-II則對供試的菌種沒有抗菌活性，其它5個成員顯示差異的抗菌譜。
　　 為深入研究果蠅Drs基因家族的免疫誘導模式及其

3、遺傳調(diào)控機制，本文進行了以下幾個方面的研究：(1)分析Drs基因家族成員在11種果蠅基因組中的分布及分子進化；(2)通過常規(guī)RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR(Fluoresencequantitative real time RT-PCR)方法，檢測分析黑腹果蠅成蟲中Drs基因家族的轉(zhuǎn)錄表達差異，揭示它們抗菌活性差異與免疫誘導活性差異的關系；(3)通過對Drs基因家族上游啟動子及相關轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的實驗和分析，初步探討Drs基因家族

4、的免疫誘導活性與上游調(diào)控元件的關系；(4)對果蠅Toll途徑下游轉(zhuǎn)錄因子Dif和其功能結(jié)構域RHD進行克隆表達，獲得與NF-kB位點結(jié)合實驗的靶蛋白，采用電泳遷移率變動分析(EMSA)方法，初步鑒定Drs基因上游與免疫誘導活性相關的NF-kB位點。
　　 本文研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.除了黑腹果蠅D.melanogaster存在Drs基因家族的7個成員外，在D。simulans、D.yakuba、D.erect

5、a、D.sechellis和D.ananassae5個種的基因組中也存在4～7個數(shù)目不等的Drs基因家族成員。到目前為止發(fā)現(xiàn)的Drosomycin或Drosomycin-like序列均來自于果蠅屬(Drosophila genus)的melanogaster種群(melanogaster species-group)。從DNA序列相似性角度分析，這些基因成員可以分成2大枝，第1枝由Drs-lD、Drs-lE和Drs-lF組成，包括D.t

6、riauraria中的tri-Drs-lA/B；第2枝Drs、Drs-lC、Drs-lG和Drs-lI組成，包括了D.ananassae的ana-Drs-la，ana-Drs-le，ana-Drs-lc和ana-Drs-lb，表明兩大枝的分化事件早于melanogaster種群各種亞群分化之前，而各種亞群分化后又發(fā)生了這兩枝中個基因成員的分化，而當各成員分化完畢后才發(fā)生了melanogaster種亞群(melanogasterspeci

7、es-subgroup)中五個物種的物種分化。
　　 2.用4種細菌和6種真菌對黑腹果蠅成蟲進行免疫誘導處理，在常規(guī)RT-PCR初步檢測Drs基因家族成員轉(zhuǎn)錄活性的基礎上，進一步用大腸桿菌(E.coli K12D31)、金黃葡萄球菌(S.aureus)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)對黑腹果蠅成蟲進行免疫誘導，采用實時熒光定量RT-PCR檢測Drs基因家族的基礎轉(zhuǎn)錄活性和誘導轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果表明：(1) Drs

8、基因具有最強的基礎轉(zhuǎn)錄活性，微生物免疫誘導后可顯著加強其表達；(2) Drs-lF有較強的基礎轉(zhuǎn)錄活性，但創(chuàng)傷刺激和微生物的誘導不能上調(diào)Drs-lF的表達；(3)Drs-lG、Drs-lD和Drs-lE具有微弱的基礎轉(zhuǎn)錄活性，創(chuàng)傷刺激可誘導基因的表達上調(diào)，但供試微生物的免疫誘導不能使基因的表達上調(diào)；(4) Drs-lC和Drs-lI既無基礎轉(zhuǎn)錄活性，也無誘導轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)合課題組前期關于“黑腹果蠅Drs基因家族中Drs的抗菌譜最廣”的研究

9、結(jié)果，推測Drs在黑腹果蠅Drs基因家族的免疫防御中發(fā)揮主導作用。
　　 3.通過對黑腹果蠅Drs基因家族上游啟動子的搜索，發(fā)現(xiàn)除Drs-lC外，在其他6個基因上游-150bp內(nèi)均可搜索到1～2個核心啟動子元件。通過5'RACE實驗，確定了Drs、Drs-lD、Drs-lE、Drs-lF和Drs-lG的轉(zhuǎn)錄起始位點，沒有鑒定到Drs-lC和Drs-lI的轉(zhuǎn)錄起始位點，推測Drs-lC和Drs-lI不存在起主導作用的轉(zhuǎn)錄起始位點。

10、根據(jù)Drs-lI對供試菌無抗菌活性和Drs-lC和Drs-lI在黑腹果蠅體內(nèi)無轉(zhuǎn)錄活性，推測這2個基因為假基因或正在向假基因方向發(fā)展。
　　 4.通過對黑腹果蠅Drs基因家族上游NF-kB/Rel、GATA、NF-IL6 RE和ICRE等順式調(diào)控元件的搜索分析，發(fā)現(xiàn)具有創(chuàng)傷刺激或微生物免疫誘導活性的Drs、Drs-lD、Drs-lE和Drs-lG基因的上游均存在NF-kB位點，而不存在NF-kB位點的Drs-lF、Drs-lC和

11、Drs-lI則喪失了免疫誘導活性，暗示NF-kB位點與Drs基因家族的免疫誘導特性直接相關。
　　 5.根據(jù)Dif轉(zhuǎn)錄因子與NF-kB位點的結(jié)合可能在果蠅成蟲階段促進Drs基因家族誘導表達活性的推理，克隆表達了果蠅Dif的Rel同源功能區(qū)(Rel homologydomain，RHD)，獲得用于檢測NF-kB位點的靶蛋白。采用EMSA技術，在Drs基因的上游靠近轉(zhuǎn)錄起始位點的位置鑒定到一個NF-kB位點，該位點可能參與了Drs基