柞蠶絲素蛋白的陽離子化及其用作基因載體的初步研究.pdf

1、促進(jìn)微血管網(wǎng)絡(luò)的再生，提高支架的成活率，是皮膚真皮等含血管組織的再生修復(fù)領(lǐng)域需要亟待解決的關(guān)鍵問題。將分子生物學(xué)和組織工程技術(shù)相結(jié)合用促進(jìn)血管再生的生長因子基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使相應(yīng)的生長因子得到穩(wěn)定、高效表達(dá)，是促進(jìn)血管再生的有效途徑。VEGF165和Ang-1是兩種最重要的且僅以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞的促血管再生生長因子。研究證明聯(lián)合使用Ang-1和VEGF165雙基因既有利于相互協(xié)調(diào)共同促進(jìn)血管的形成，又可使新生血管獲得持久穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。尋

2、找合適的可降解性生物材料作為基因傳遞載體，使目的基因靶向、可控并有效地表達(dá)，是基因治療血管再生及皮膚組織工程等領(lǐng)域共同關(guān)注的問題。
　　柞蠶絲素是一種低免疫原性的物質(zhì)，能被完全降解成多肽和游離氨基酸。柞蠶絲素蛋白含有細(xì)胞特異性黏附RGD序列，且含有較多的帶極性側(cè)鏈的氨基酸殘基能夠作為化學(xué)改性的潛在反應(yīng)位點，這些優(yōu)點及特性為柞蠶絲素蛋白作為基因載體的可行性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本文用精胺對柞蠶絲素蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，使改性后的柞

3、蠶絲素蛋白在生理環(huán)境下帶正電荷，得到陽離子化的柞蠶絲素蛋白(CASF)。并以陽離子化的柞蠶絲素蛋白作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的傳遞載體。
　　首先通過碳化二亞胺法(EDC)使精胺接枝于柞蠶絲素蛋白。Zeta電位分析結(jié)果表明，經(jīng)精胺改性后，相同pH條件下水溶液中柞蠶絲素蛋白的Zeta電位從負(fù)值上升到7.92，當(dāng)精胺與柞蠶絲素的質(zhì)量比大于8%后，絲素的Zeta電位上升幅度減小。紅外吸收光譜顯示精胺與柞蠶絲素蛋白中羧

4、基反應(yīng)，生成酰胺鍵。三硝基苯磺酸法(TNBS)證實了修飾過后的柞蠶絲素蛋白中伯氨基含量有所增加。并且精胺改性后，柞蠶絲素蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生了無規(guī)卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)的明顯轉(zhuǎn)變。
　　其次采用堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA，并通過靜電吸附制備陽離子化絲素/DAN復(fù)合物。研究結(jié)果表明，陽離子化的柞蠶絲素能與DNA形成帶正電的復(fù)合物，并且形成的復(fù)合物為緊密的顆粒狀，粒徑分布在100-500 nm。
　　最后MTT法檢測復(fù)合物

5、的細(xì)胞相容性，研究結(jié)果表明用陽離子化的柞蠶絲素包被質(zhì)粒DNA比用PEI包被質(zhì)粒DNA的細(xì)胞毒性小。激光共聚焦顯微鏡(LSCM)和流式細(xì)胞儀檢測 GFP陽性細(xì)胞比率結(jié)果表明，陽離子化的柞蠶絲素蛋白可以作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的傳遞載體，并且C8-ASF/DNA(48:1)組的復(fù)合物轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞與hy.EA926細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為15.28%，32.88%，均明顯高于PEI/DNA組的轉(zhuǎn)染效率。
　　通過本