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文檔簡介
1、目的:彌漫性軸索損傷(DAI)是指頭部遭受鈍性特殊外力,產(chǎn)生加速運動時,在剪應(yīng)力的作用下,腦內(nèi)發(fā)生的以神經(jīng)軸索腫脹、斷裂為特征的一系列的病理生理變化,可單獨出現(xiàn)也可伴隨其他病理改變。典型的表現(xiàn)為意識障礙,臨床診斷較困難且預(yù)后差。已有研究表明,DAI造成外傷后的腦功能障礙不僅是由于最初的機(jī)械外力等作用所致的原發(fā)性損傷,很大程度上與損傷后發(fā)生的復(fù)雜的神經(jīng)元“二次打擊”(神經(jīng)元繼發(fā)性損傷)有關(guān)。
前期實驗已經(jīng)觀察到大量的小膠質(zhì)細(xì)
2、胞在DAI后被激活,且小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及呼吸爆發(fā)在DAI后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用。但是神經(jīng)損傷的機(jī)制不僅限于直接的細(xì)胞因子的作用,小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的毒性作用更為重要。研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不僅起支持和營養(yǎng)作用,同時作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)興奮性氨基酸代謝的重要場所,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可釋放大量的興奮性氨基酸,同時興奮性氨基酸也可進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞。而興奮性氨基酸過多產(chǎn)生的興奮毒性作用在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可以導(dǎo)致神經(jīng)損
3、傷,包括炎癥、缺血及神經(jīng)退行性變。而小膠質(zhì)細(xì)胞在DAI模型中介導(dǎo)的興奮性氨基酸在神經(jīng)損傷中的作用尚不明確。
本實驗旨在參照1994年[5]MarmarouA等的方法建立大鼠DAI模型,并給予小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抑制劑米諾環(huán)素進(jìn)行治療,采用小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物,通過免疫組織化學(xué)方法,觀察DAI后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分布特點及米諾環(huán)素對小膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制作用。并通過高效液相色譜對腦組織中的興奮性氨基酸進(jìn)行定量分析,觀察DAI后興奮
4、性氨基酸的變化及米諾環(huán)素對興奮性氨基酸變化的影響,探討興奮性氨基酸的促損傷作用。以期為法醫(yī)學(xué)實際檢案工作中對DAI損傷的客觀評價提供理論依據(jù),并為臨床治療提供新思路。
方法:Sprague-Dawley大鼠(體重:260±28g)隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組、損傷組、治療組;每組包括9個不同時相:0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d。參照MarmarousA等的方法制備大鼠腦DAI模型。
假
5、手術(shù)組大鼠給予手術(shù)及打擊前處理,但不予打擊;損傷組和治療組給予打擊;打擊后治療組腹腔注射米諾環(huán)素(45mg/kg),之后每天一次,直至動物被處死。損傷組在與治療組相同時間點腹腔注射同劑量的生理鹽水。根據(jù)打擊后按不同時間給予10%水合氯醛麻醉后取全腦,制作石蠟切片,采用HE染色觀察大鼠腦組織的病理改變。用免疫組織化學(xué)的方法測定腦組織中皮層及腦干損傷區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)狀況。用高效液相色譜法測定腦組織中興奮性氨基酸的含量變化。
6、統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組小膠質(zhì)細(xì)胞灰密度值及興奮性氨基酸各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),以p<0.05為有顯著性差異。
結(jié)果:
1、成功建立彌漫性軸索損傷模型:常規(guī)HE染色觀察,損傷后12h組織結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)元變性水腫明顯,部分神經(jīng)元壞死,大量小膠質(zhì)細(xì)胞增生伴嗜神經(jīng)現(xiàn)象;損傷后24-48h組織損傷加重。72h逐漸好轉(zhuǎn)。而治療組各時
7、段與損傷組相比,組織疏松程度較輕,小膠質(zhì)細(xì)胞增生較少,水腫不明顯。
2、CD11b免疫組化結(jié)果的觀察:損傷組6h時CD11b染色較淺,數(shù)量較少;打擊后12h小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加突起變粗、變短,胞體增大、變圓。皮層CD11b的表達(dá)在打擊后12h達(dá)到高峰,腦干CD11b的表達(dá)在打擊后24h達(dá)到高峰;之后逐漸減少;72h仍可見。治療組與損傷組小膠質(zhì)細(xì)胞的激活趨勢相同,但數(shù)量及形態(tài)上有一定差異。治療組表達(dá)在6h前與損傷組沒有統(tǒng)計
8、學(xué)差異。12h、24h、48h、72h與損傷組有明顯差異。
3、高效液相色譜對谷氨酸及天門冬氨酸的測定:各組腦組織測定結(jié)果:與假手術(shù)組相比,損傷組皮層腦組織在損傷后谷氨酸及天門冬氨酸即有明顯升高,12h到達(dá)高峰,之后逐漸下降,7d后基本恢復(fù)正常。而治療組與損傷組趨勢相同,12h-72h均低于損傷組,72h己基本恢復(fù)正常。
損傷組腦干組織在損傷后谷氨酸和天門冬氨酸即明顯高于正常,24h達(dá)到高峰,之后逐漸下降,7
9、d后基本恢復(fù)正常。而治療組與損傷組趨勢相同,12h-72h均低于損傷組,72h已基本恢復(fù)正常水平。
結(jié)論:采用MarmarouA的自由落體撞擊模型復(fù)制了大鼠DAI模型,觀察到DAI后米諾環(huán)素可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,且大鼠皮層及腦干谷氨酸及天門冬氨酸的含量與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在時空上相關(guān)。米諾環(huán)素可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用降低腦組織中谷氨酸及天門冬氨酸的含量;在一定程度上說明興奮性氨基酸與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活密切相關(guān)。小膠
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