膠原蛋白的提取工藝、質(zhì)量分析研究及其在生物膜材料中的應(yīng)用.pdf

1、目的：膠原蛋白作為天然動物生物質(zhì)資源，在生物材料等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用深受國內(nèi)外關(guān)注。膠原蛋白顯著的低免疫原性、生物相容性、可降解性，具有止血功能，并且在生物體內(nèi)容易被吸收，親水性強、無毒安全性好，是作為生物材料的優(yōu)勢，目前特別是在組織工程材料方面膠原蛋白得到了廣泛的應(yīng)用研究。本文在膠原蛋白的提取、質(zhì)量分析方面及其生物膜方面的應(yīng)用進行了一些創(chuàng)新性研究。 方法： 1.膠原蛋白提取工藝的研究： 本研究以牛跟鍵為制備

2、原料，比較酸溶法、酶解法、中性鹽溶液法三種粗提方法，選擇得率和純度都較高的方法為最佳粗提法，結(jié)合高效液相色譜進行膠原蛋白的分離純化。 2.膠原蛋白的質(zhì)量的研究通過膠原蛋白理化性質(zhì)研究：SDS-PAGE測定：紫外最大吸收測定；氨基酸測定；色譜分析純度，對膠原蛋白的質(zhì)量進行控制。通過小鼠急性毒性試臉、豚鼠致敏試驗、細胞毒性試驗對自制膠原蛋白進行整體水平和細胞水平的生物安全性評價。 3.對膠原生物膜材料應(yīng)用的研究用提取的膠

3、原樣品冷凍干燥成膜，根據(jù)生物膜材料的特性要求，本文選用了具有獨特的生理、藥理活性的單寧酸為交聯(lián)劑。通過考察單寧吸收量和膠原膜穩(wěn)定性之間的關(guān)系、單寧酸交聯(lián)的膠原膜的熱穩(wěn)定性和抗酶解能力來評價單寧酸交聯(lián)膜。結(jié)果： 1.膠原蛋白提取工藝的研究： 在酸溶法、酶解法、中性鹽溶液法三種粗提方法中，選擇得率和純度都較高的方法酶解法；結(jié)合高效液相色譜進行膠原蛋白的分離純化得到的I型膠原蛋白與I型膠原蛋白標準品的保留時間一致，樣品的保

4、留時間是14.348，標準品的保留時間是14.251。 2.膠原蛋白的質(zhì)量分析的研究樣品在223 nm處有紫外最大吸收值：含有十八種氨基酸，氨基酸總量在90％以上；樣品的蛋白質(zhì)濃度為1.03mg/ml；SDS-PAGE測定Ⅰ型膠原蛋白由α、β、γ三條鏈組成；色譜分析純度約為100％。通過小鼠急性毒性試臉、豚鼠致敏試驗、細胞毒性試驗對自制膠原蛋白進行整體水平和細胞水平的生物安全性評價，觀察期內(nèi)，小鼠未見異常毒性反應(yīng)：豚鼠注射點無

5、紅斑及水腫情況：細胞毒性小于1級，結(jié)果證明本方法制備的膠原蛋白無毒副作用。 3.膠原生物膜材料的研究3.1膠原經(jīng)交聯(lián)和干燥后，單寧酸的吸收量達到15～34％。 3.2，隨著單寧酸被膠原膜的吸收量增加，單寧酸在膠原膜內(nèi)被結(jié)合的量也有所增加，引起了Tm的提高。 3.3未交聯(lián)膠原膜、戊二醛交聯(lián)膠原膜、和單寧酸交聯(lián)膠原膜三種樣品，各切成均勻小樣4片。按10U/mg膠原計算酶的用量，將小樣置于該胰蛋白酶清液中處理消化

6、。消化時間為4h，期間注意變化，每個樣品共取樣四次，取樣后用大量蒸餾水仔細漂洗，停止酶降解反應(yīng)。酶降解后測定膠原膜機械性能變化。可以看出，未交聯(lián)膠原膜降解迅速，接近40min內(nèi)即喪失90％左右的抗張強度；戊二醛交聯(lián)膠原膜在40min左右還保留著50％的抗張強度，臨近4h酶解過程結(jié)束時，抗張強度明顯降低；而單寧酸交聯(lián)的膠原膜變化不大。 結(jié)論： 1.以牛跟鍵為材料，選擇得率和純度都較高的酶解法為最佳粗提法，結(jié)合高效液相色

7、譜制備Ⅰ型膠原蛋白。 2.通過紫外光譜掃描、氨基酸組成及含量測定、蛋白質(zhì)濃度、SDS-PAGE和RP-HPLC分析對所提取的I型膠原蛋白進行理化性質(zhì)鑒定，結(jié)果證明上述制備方法可得到純度較高的Ⅰ型膠原蛋白。體內(nèi)外安全性實驗結(jié)果表明本方法制備的Ⅰ型膠原蛋白無毒副作用。 3.膠原生物膜材料的研究3.1膠原膜對單寧酸的吸收量達到15-34％。單寧酸溶液濃度越高，膠原膜吸收的單寧酸就越多。 3.2在交聯(lián)過程中，吸收量