一種新型miRNA功能測定系統(tǒng)的建立.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類19-25bp內(nèi)源非編碼小RNA，在真核生物中普遍存在。多數(shù)miRNA采用Ⅱ型啟動子起始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在加工成熟過程中依次經(jīng)歷了三種主要形式：初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物primarymiRNA(pri-miRNA)，發(fā)卡狀前體(precursormiRNA，pre-miRNA)，和成熟體miRNA(maturemiRNA)。目前有關(guān)miRNA功能的研究主要證實其成熟體對靶標基因的表達起負調(diào)控作用。 常用的m

2、iRNA的研究方法主要是功能缺失或獲得實驗。測定待研究的miRNA的效應(yīng)可以在表達該miRNA的細胞系或不表達該miRNA的細胞系中分別進行。對于前者可以通過使用甲基修飾的反義寡核苷酸敲除該miRNA，抑制它的功能活性。對于后者則可以通過轉(zhuǎn)染化學合成的miRNA或轉(zhuǎn)染miRNA表達載體，實現(xiàn)該miRNA功能的增強或獲得。直接轉(zhuǎn)染化學合成的miRNA對進行一般的研究工作固然方便快捷，但費用高、轉(zhuǎn)染效果維持短暫，這對滿足長周期體外體內(nèi)實驗的

3、要求，適應(yīng)未來應(yīng)用于臨床治療等方面都不如miRNA表達載體。 目前文獻中報導(dǎo)使用過的miRNA表達載體，按照載體直接轉(zhuǎn)錄出的miRNA的形式劃分，大致有以下三類，即primarymiRNA載體，precursormiRNA載體，和maturemiRNA載體，這些載體各自的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物依次進入內(nèi)源miRNA加工成熟過程的不同階段，利用內(nèi)源miRNA加工成熟通路及內(nèi)源miRNA行施功能的機制，來實現(xiàn)外源miRNA的表達與功能。對這三類載

4、體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生外源miRNA的效率，對內(nèi)源miRNA的產(chǎn)生及功能的影響，對外源miRNA是否能完全模擬內(nèi)源miRNA而被整合進入miRISC等各方面的集中比較分析鮮見報道。 本實驗起初為了能夠找到miRNA的最佳表達載體以及構(gòu)建特定miRNA靶標基因檢測系統(tǒng)，依據(jù)相關(guān)文獻報導(dǎo)結(jié)合shRNA的設(shè)計原理，以人類miRNAlet-7a為代表，依次構(gòu)建出pri-miRNA載體，模仿shRNA的pre-miRNA載體，和maturemiRNA

5、載體，以及含有l(wèi)et-7a靶點的熒光效應(yīng)元件，希望通過分析比較三種形式的miRNA表達載體對含let-7a靶標HMGA23’末端非翻譯區(qū)(HMGA23’UTR)的熒光效應(yīng)元件的抑制效果及程度，來初步尋找最佳的miRNA表達載體以及構(gòu)建let-7a靶標基因3’UTR的檢測系統(tǒng)。但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)沒有合適的細胞系能夠作為工具性細胞系，即不對含HMGA23’UTR的熒光效應(yīng)元件產(chǎn)生內(nèi)源性干擾。為了解決這一矛盾，找到miRNA熒光效應(yīng)元件不受細

6、胞系內(nèi)源性miRNA表達譜影響的方法，突破細胞系的種類對檢測特定miRNA的限制，產(chǎn)生具有普遍適用性的細胞系，我們采用RNAi的方法，直接敲除內(nèi)源miRNA加工成熟通路上的關(guān)鍵蛋白(但避開外源miRNA加工成熟所需的蛋白)，或直接特異性敲除內(nèi)源let-7a，嘗試構(gòu)建減少細胞內(nèi)源miRNA背景對熒光效應(yīng)元件影響的一種新型的miRNA功能測定系統(tǒng)，以期在這樣一個檢測系統(tǒng)內(nèi)對不同形式的miRNAlet-7a表達載體表達外源let-7a的效率進

7、行評價。 在Hela細胞系內(nèi)我們初步完成了對這一工作的前期準備和探討研究。通過實驗的方法證實了在Hela細胞系中我們自行設(shè)計的用于RNAi敲除實驗的基礎(chǔ)載體質(zhì)粒pcDNA3-H1和shRNA表達框架是成功的，可以用于進行干擾內(nèi)源蛋白或干擾內(nèi)源miRNA表達的實驗。通過RNAi實驗，發(fā)現(xiàn)pcDNA3-H1-sh-A-R-let-7a對含有HMGA23’UTR的熒光效應(yīng)元件恢復(fù)熒光的效果最好。但是熒光恢復(fù)的程度相對比較微弱，這對我們