StRFP1在馬鈴薯晚疫病抗性中的作用研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界四大糧食作物之一，在保障世界糧食安全中起著重要作用。馬鈴薯生產中最嚴重的病害是由卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病。系統解析馬鈴薯晚疫病抗性機制，對于探索和尋找晚疫病防治策略，指導抗病育種和晚疫病科學防治具有重要意義。大量研究證明翻譯后修飾在植物PTI和ETI免疫應答中起重要的作用。通過泛素化調節(jié)蛋白的穩(wěn)定性是重要的

2、轉錄后水平的調控途徑之一。許多RING類型的E3s參與植物免疫信號的傳遞和調節(jié)。ATL家族是帶有RING類型的泛素連接酶蛋白，包含跨膜結構域、GLD結構域和RING結構域，ATL家族的蛋白廣泛參與調節(jié)植物的生長發(fā)育、抗病抗逆反應。前期研究表明馬鈴薯ATL家族基因StRFP1參與晚疫病抗性，本研究克隆了茄科抗病研究模式植物本氏煙中StRFP1的同源基因NbATL60，在馬鈴薯和本氏煙中進一步系統深入研究了StRFP1在免疫應答調控中的作用

3、。主要研究結果如下:
　　1.通過檢測晚疫病菌培養(yǎng)液（CF，含有潛在晚疫病菌PAMPs）和PAMPs flg22處理后馬鈴薯和本氏煙中StRFP1和NbATL60的基因表達，發(fā)現這兩個基因均能夠強烈響應CF和flg22的誘導表達，表明StRFP1和NbATL60參與茄科植物的PTI應答。
　　2.StRFP1和NbATL60具有預測的跨膜結構域，激光共聚焦顯微觀察表明StRFP1-GFP和NbATL60-GFP蛋白主要分布在

4、細胞膜上，同時在內質網和胞內觀察到很強的點狀熒光信號，預示這兩個蛋白在膜和胞內存在動態(tài)轉運。另外，顯微觀察發(fā)現，CF和flg22處理不會影響瞬時表達StRFP1和NbATL60的亞細胞定位。
　　3.體外泛素活性檢測研究表明，去除跨膜域的原核表達蛋白StRFP137-262和NbATL6034-256具有E3泛素連接活性。突變RING finger結構域的StRFP137-262(H124A)和NbATL6034-256(H127

5、A)喪失泛素活性，證明RING finger結構域是E3泛素連接活性的關鍵結構域。
　　4.用強毒力晚疫病菌小種進一步鑒定馬鈴薯StRFP1超量和干涉轉基因株系晚疫病抗性，結果表明超量株系抗性提高，干涉株系抗性下降。同時在本氏煙上瞬時表達StRFP1-MYC和NbATL60-MYC后顯著提高晚疫病抗性，但是瞬時表達喪失泛素活性的RING finger突變體StRFP1-mut-MYC和NbATL60-mut-MYC則不能抑制晚疫病

6、菌擴展，表明E3泛素連接酶活性是StRFP1和NbATL60實現免疫調控功能所必需的。
　　5.利用病毒介導的基因沉默(VIGS)方法在本氏煙中沉默NbATL60。發(fā)現沉默株系表現明顯的矮化表型，預示NbATL60參與調節(jié)植株生長發(fā)育?？剐栽u價表明VIGS NbATL60本氏煙晚疫病抗性顯著下降。表明StRFP1和NbATL60在調控晚疫病抗性免疫應答中具有相同的功能。已有研究顯示，部分ATLs參與調控細胞死亡，本研究發(fā)現沉默Nb

7、ATL60不能抑制晚疫病菌PAMP INF1以及R基因及相應無毒基因對Rx/Cp、R2/Avr、R3a/Avr3a和Pto/AvrPto誘發(fā)的細胞死亡。
　　6.在StRFP1馬鈴薯轉基因株系和VIGS沉默NbATL60本氏煙中檢測了4個PTI途徑marker基因對CF和flg22的響應。結果發(fā)現，超量表達轉基因株系中WRKY7、WRKY8和ACRE31表達極顯著增加，而在干涉株系中4個PTI marker基因均下調表達。在VIG

8、S沉默NbATL60本氏煙中，N6WRKY7，N6WRKY7，NbACRE31和NbPti5均表現下調趨勢。因此，StRFP1和NbATL60均參與調控PTI途徑抗病防御基因的表達。
　　7.為了進一步探究StRFP1在植物免疫中如何與其靶標結合發(fā)揮功能，本研從膜系統酵母文庫篩選出71個陽性克隆，通過酵母點對點驗證，發(fā)現3個強互作蛋白Stβ-GLU08、StHMA和StLD以及兩個弱互作蛋白StACY和St14-3-3。黃色熒光互