中藥復(fù)雜體系中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的HPLC-MS分析及半枝蓮中黃酮類成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)集HPLC的高效分離能力和MS的高靈敏度、強(qiáng)結(jié)構(gòu)定性功能于一體，成為中藥化學(xué)成分鑒定的有力分析工具。呋喃香豆素類化合物是多種中藥的主要活性成分，因其抗病毒、抗腫瘤、抗菌，特別是抗HIV活性而受到廣泛關(guān)注。呋喃香豆素中存在多種同分異構(gòu)體，如何在復(fù)雜體系中鑒定這些分子量相同、結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體，成為主要以質(zhì)量數(shù)識(shí)別化合物的HPLC-MS技術(shù)面臨的難題。本研究即以呋喃香豆素類同分異構(gòu)體為研究對(duì)象，以北

2、沙參、白芷、前胡、獨(dú)活和補(bǔ)骨脂為研究載體，以HPLC-MS技術(shù)為分析手段，通過總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立HPLC-EPI液質(zhì)聯(lián)用新掃描方式，探討中藥復(fù)雜體系中同分異構(gòu)體鑒定的方法學(xué)，以期為同分異構(gòu)體的質(zhì)譜研究提供新方法和新思路。
　　半枝蓮(Scutellaria barbata)為唇形科植物半枝蓮(Scutellaria barbata)的干燥全草?！吨袊幍洹酚涊d本品味辛、苦，性寒，歸肺、肝腎經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿清腫的

3、功能，是臨床常用中藥。黃酮類化合物是半枝蓮的主要生理活性物質(zhì)。本研究以專屬性強(qiáng)、靈敏度高的HPLC-MS技術(shù)為分析手段，采用水解和不水解2種血漿樣品處理方式，分別測定了大鼠灌胃半枝蓮后血漿中5種黃酮類成分的游離型含量和總量，初步探討了半枝蓮中黃酮類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特征。
　　第一部分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究
　　目的：研究呋喃香豆素類同分異構(gòu)體在軟電離技術(shù)(大氣壓化學(xué)電離源和電噴霧離子源)下質(zhì)譜裂解差異和規(guī)

4、律，建立穩(wěn)定、快速的可用于鑒定呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜方法。
　　方法：分別配制補(bǔ)骨脂素/異補(bǔ)骨脂素、花椒毒素/佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素/異歐前胡素、茴芹內(nèi)酯/異茴芹內(nèi)酯4對(duì)呋喃香豆素類同分異構(gòu)體對(duì)照品的甲醇儲(chǔ)備液，用甲醇-水(1:1，v/v)分別稀釋至濃度為1μg/mL。針泵進(jìn)樣，流速為10μL/min。通過大氣壓化學(xué)電離源(APCI)和電噴霧離子源(ESI)下正負(fù)離子多級(jí)掃描、母離子掃描、中性丟失掃描研究其質(zhì)譜裂解途徑和差異，

5、采集在不同碰撞誘導(dǎo)解離電壓下子離子掃描中主要碎片的相對(duì)豐度值，采集時(shí)間為2 min。
　　結(jié)果：1.系統(tǒng)總結(jié)了區(qū)分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的7個(gè)質(zhì)譜裂解規(guī)律，如相對(duì)豐度比區(qū)分法、利用特征性離子m/z203和185或用[M+NH4]+和[M+Na]+峰的相對(duì)豐度值區(qū)分取代基的位置等。2.發(fā)現(xiàn)區(qū)分呋喃香豆素同分異構(gòu)體的共性質(zhì)譜規(guī)律-相對(duì)豐度比法。公式為R=M/N，M和N分別代表互為同分異構(gòu)體的一對(duì)香豆素類化合物各自主要碎片離子的相對(duì)豐度

6、比值。對(duì)于單氧(雙氧)取代的化合物，當(dāng)R值大于1時(shí)，M為C-5(C-8較活潑取代基)取代的化合物，N為C-8(C-5較活潑取代基)取代的化合物。
　　結(jié)論：本法首次系統(tǒng)地將主要碎片離子豐度比法用于呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的區(qū)分?？偨Y(jié)的質(zhì)譜裂解規(guī)律穩(wěn)定性好、特征性強(qiáng)，可用于呋喃香豆素同分異構(gòu)體的質(zhì)譜快速鑒定。
　　第二部分 HPLC-EPI液質(zhì)掃描模式的建立及其在中藥成分分析中的應(yīng)用
　　目的：建立一種可獲得穩(wěn)定性高、重現(xiàn)

7、性好、專屬性強(qiáng)的化合物質(zhì)譜信息的分析方法，并用于多種中藥材復(fù)雜體系中化合物的分析與鑒定。
　　方法：配制補(bǔ)骨脂素/異補(bǔ)骨脂素、花椒毒素/佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素/異歐前胡素、茴芹內(nèi)酯/異茴芹內(nèi)酯4對(duì)呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為1μg/mL。采用超聲提取法制備北沙參、白芷、獨(dú)活、前胡和補(bǔ)骨脂的50％乙醇提取液，減壓蒸干，殘?jiān)鼜?fù)溶于50％甲醇中，高速離心取上清液，作為供試品溶液。采用C18柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為1 m

8、mol/L的醋酸銨水-甲醇，梯度洗脫。質(zhì)譜檢測采用ESI源，正離子掃描，增強(qiáng)型子離子掃描(EPI)模式，掃描離子為各個(gè)化合物的[M+H]+峰，線性離子阱填充時(shí)間為30 ms，Q0富集，在碰撞電壓為25、30和40 eV下進(jìn)行檢測。對(duì)HPLC-EPI模式中分析物質(zhì)譜信息進(jìn)行精密度與穩(wěn)定性的研究，記錄HPLC-EPI模式與多離子監(jiān)測-信息依賴-增強(qiáng)子離子掃描(HPLC-MRM-IDA-EPI)模式和母離子掃描-信息依賴-增強(qiáng)子離子掃描(HP

9、LC-PREC-IDA-EPI)模式在相同檢測條件下主要碎片離子的相對(duì)豐度值，采用SPSS16.0中的波動(dòng)性差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較分析。
　　結(jié)果：HPLC-EPI模式中，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液中待測化合物的碎片離子相對(duì)豐度值的精密度和穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10％，質(zhì)譜信息較為穩(wěn)定。在HPLC-MRM-IDA-EPI與HPLC-PREC-IDA-EPI模式中，待測化合物的碎片離子豐度值波動(dòng)在0.0-13.7％之間，而HP

10、LC-EPI模式中，待測化合物的碎片離子豐度值波動(dòng)在0.0-2.3％之間。這說明在HPLC-EPI模式下更有利于得到穩(wěn)定的質(zhì)譜信息。
　　結(jié)論：本法穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可用于在中藥復(fù)雜分析體中化合物穩(wěn)定質(zhì)譜信息的獲得和鑒定。
　　第三部分北沙參、白芷、前胡、獨(dú)活和補(bǔ)骨脂中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體HPLC-MS鑒定
　　目的：鑒定和識(shí)別北沙參、白芷、前胡、獨(dú)活和補(bǔ)骨脂中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。
　　方法：采

11、用超聲提取法制備5種藥材的50％乙醇提取液，減壓蒸干，殘?jiān)鼜?fù)溶于50％甲醇中，高速離心取上清液進(jìn)行HPLC-MS分析。聯(lián)合使用HPLC-EPI、HPLC-MRM-IDA-EPI和HPLC-PREC-IDA-EPI3種掃描模式，結(jié)合呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律，鑒定北沙參、白芷、前胡、獨(dú)活和補(bǔ)骨脂中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。根據(jù)母離子掃描中同時(shí)出現(xiàn)的[M+H]+和[M+NH4]+峰離子信息判斷未知呋喃香豆素類化合物的分子量，根據(jù)3種

12、模式產(chǎn)生的碎片離子信息及主要裂解途徑上碎片離子的相對(duì)豐度比規(guī)律區(qū)分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。采用C18柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為1mmol/L醋酸銨水-甲醇，梯度洗脫。
　　結(jié)果：鑒定出5種中藥材中18對(duì)呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。其中，北沙參中9對(duì)，白芷中12對(duì)，前胡中8對(duì)，獨(dú)活中7對(duì)，補(bǔ)骨脂中5對(duì)。
　　結(jié)論：HPLC-EPI掃描模式與呋喃香豆素類同分異構(gòu)體質(zhì)譜裂解規(guī)律的有機(jī)結(jié)合，可快速、穩(wěn)定的區(qū)分5種中藥復(fù)雜分析體系中18對(duì)呋

13、喃香豆素類同分異構(gòu)體。
　　第四部分半枝蓮中5種黃酮類成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　目的：建立可同時(shí)測定大鼠血漿中游離型和結(jié)合型野黃芩苷、柚皮素、芹菜素、木犀草素和漢黃芩素含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給與半枝蓮提取物后該5種成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　方法：大鼠灌胃給與半枝蓮提取物(2.35 mL/kg)后，分別于給藥后0.08，0.5，4，5，6，8，12，24，36，48 h眼內(nèi)眥靜脈叢取血，每次取0.3

14、mL制備血漿樣品，將血漿均分成兩部分，分別采用酸水解并液-液萃取和直接液-液萃取兩種方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，提取溶劑為乙酸乙酯，磺胺甲惡唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為0.01％乙酸水-甲醇(35:65，v/v)，運(yùn)行時(shí)間為12.5 min。采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行檢測。5種被測成分和內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測離子對(duì)分別為野黃芩苷m/z461.1/285.1，柚皮素m/z271.0/119.0，芹菜素m/z2

15、69.0/117.0，木犀草素m/z285.0/132.9，漢黃芩素m/z283.0/268.0，磺胺甲惡唑m/z252.0/155.9。
　　結(jié)果：所有標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9915)，最低定量限(LLOQ)≤9.15ng/mL。日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于14.8％，相對(duì)誤差(RE)為-12.4-14.0％，提取回收率為53.8-84.2％，基質(zhì)效應(yīng)為81.9-103.3％。大鼠灌胃半枝蓮

16、提取物后，血漿中該5種成分的游離型t1/2在4.95-9.56 h之間，磁在0.001到0.0024之間，說明這5種成分在體內(nèi)消除較慢。除野黃芩苷出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象外，其余4種成分的游離型藥時(shí)曲線具有一致性。柚皮素、芹菜素、木犀草素和漢黃芩素結(jié)合型的AUC0→∞占總AUC0→∞的54.5-81.3％，并且結(jié)合型的Cmax是游離型的2倍之多，說明黃酮苷元類在體內(nèi)極易轉(zhuǎn)化成其結(jié)合形式存在并可能存在首過效應(yīng)。
　　結(jié)論：本法專屬性強(qiáng)、靈敏度