利用RNA干擾技術(shù)提高番茄抗TMV侵染能力的研究.pdf_第1頁
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1、煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)是RNA病毒的一種,主要侵染煙草及其他茄科植物,在寄主體內(nèi)完全寄生性生存,侵染植物危害嚴(yán)重,尤其是嚴(yán)重威脅栽培作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。番茄病毒病害在番茄生產(chǎn)栽培中危害較大,在我國(guó)大部分番茄栽培區(qū)內(nèi)普遍發(fā)生。煙草花葉病毒就是其主要病毒病原這一。生產(chǎn)中普遍采用的防治手段是選育抗病品種,常規(guī)的雜交育種培育抗病品種存在一定的局限性,而 RNA干擾(RNA interference,RNA

2、i)技術(shù)作為一種分子生物學(xué)手段為植物病毒病害防治開辟了一條新途徑。
  基于 RNAi機(jī)制,以TMV復(fù)制酶基因(TMV-replicase,TMV-r)為 RNAi的靶向基因,在NCBI網(wǎng)站對(duì)靶向基因進(jìn)行序列同源性比對(duì),確定RNAi的靶標(biāo)序列,設(shè)計(jì)上下游引物,經(jīng)RT-PCR從感染TMV病毒的煙草葉片中克隆靶向基因的靶序列片段。借助限制性內(nèi)切酶將靶序列正向、反向構(gòu)建到含35S超強(qiáng)啟動(dòng)子的RNAi表達(dá)載體相應(yīng)克隆位點(diǎn),特異引物PCR反

3、應(yīng)及酶切反應(yīng)檢測(cè)載體構(gòu)建結(jié)構(gòu)正確。經(jīng)凍融法將表達(dá)載體重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,完成雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建。經(jīng)葉盤法侵染番茄無菌苗,結(jié)合組織培養(yǎng)及激素誘導(dǎo),通過抗生素選擇性培養(yǎng)基篩選出9株番茄轉(zhuǎn)化苗,繼續(xù)培育后經(jīng)特異引物PCR和NOS終止子引物PCR檢測(cè),確定3株為RNAi轉(zhuǎn)基因番茄苗。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄人工接種TMV病毒并調(diào)查感病進(jìn)展。結(jié)果表明:與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗严啾?,轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TMV的抗病能力顯著提高,兩株達(dá)到顯著抗病水平。選取表現(xiàn)

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