甲嘧磺隆的微生物降解作用研究.pdf

1、利用生物修復法來降低環(huán)境中的農藥是行之有效的措施之一,在諸多的農藥生物修復方法中以微生物修復的研究和應用最為廣泛,尤其微生物修復環(huán)境中長殘效農藥的研究較多。甲嘧磺隆是一種超高效、廣譜、持效期長的磺酰脲類除草劑,在世界范圍內廣泛應用于林業(yè)及非耕地雜草的防除。甲嘧磺隆性質穩(wěn)定、不易降解、在環(huán)境中持效期長,因此對敏感作物很容易造成藥害。甲嘧磺隆的水溶性較高,在土壤中的移動性較強,易造成對地下水的污染,因此,對甲嘧磺隆微生物降解作用的研究具有一

2、定的實踐意義。而關于甲嘧磺隆的微生物降解作用研究鮮見報道,本研究通過富集培養(yǎng)的方法從土壤和水中分離篩選出19株可降解甲嘧磺隆的微生物,對其中降解能力較強的JH2和JH3菌株進行了降解特性及降解機理研究,主要研究結果如下:
　　 1.降解甲嘧磺隆微生物的篩選。利用富集培養(yǎng)技術從生產甲嘧磺隆農藥廠的廢水中分離得到了19株能夠降解甲嘧磺隆的微生物,通過測定不同菌株對甲嘧磺隆的降解率發(fā)現(xiàn):供試菌株對低濃度甲嘧磺隆的降解率要顯著高于高濃度

3、的降解率,在培養(yǎng)基中甲嘧磺隆的含量為5mg·L-1時,JH3菌株的降解率最高,為98.9％,其次是JH2菌株,降解率為95.3%。對其中降解作用較強的7個菌株進行鑒定,其中JH3菌株為睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni);JH2菌株為食酸叢毛單胞菌(Delftia subsp);JH10菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);JH6菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amylolique

4、faciens);SH3菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);SH5菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);SH4菌株為沙門氏菌(salmonella sp.)。
　　 2.JH2、JH3菌株的降解特性及降解機理研究。結果表明,JH2菌株的最適降解培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基Ⅲ,以甲嘧磺隆濃度為5mg·L-1時JH2、JH3菌株降解率最高;JH2菌株對甲嘧磺隆降解的適宜溫度為30℃,JH2菌株接種量為

5、1×108CFU·mL-1,轉速為150r·min-1,培養(yǎng)120h對甲嘧磺隆的降解率最高:JH3菌株對甲嘧磺隆降解的適宜溫度為35℃,接種量為1×107CFU·mL-1,轉速為150r·min-1,培養(yǎng)72 h時對甲嘧磺隆的降解率最高;通過對JH2、JH3菌株進行作用機理研究,兩菌株降解產物的特征峰基本相同,降解產物的主要碎片離子為m/z198、分子式為C8H7O4S的化合物,其紫外檢測的保留時間為3.0min,推斷甲嘧磺隆結構式中的

6、另一半結構可能降解為鏈狀烷烴,沒有紫外吸收,也不能離子化,因此沒有特征峰。以此判斷JH2、JH3對甲嘧磺隆降解的作用位點在S-N鍵。
　　 3.JH2、JH3菌株降解酶活性研究。通過JH2、JH3菌株對甲嘧磺隆降解酶定域表達試驗表明,兩菌株的胞內酶和胞外酶均有活性,降解甲嘧磺隆的關鍵酶都主要是胞外酶且降解酶誘導表達。在LB液體培養(yǎng)基中,當甲嘧磺隆濃度為5mg·L-1、接種量為2.3×108CFU·mL-1、初始pH值為8.0、溫

7、度30℃、轉速為150r·min-1、培養(yǎng)時間120 h時JH2菌株胞外粗酶的酶比活最高達到85.8U·mg-1;其酶促反應體系的甲嘧磺隆最適濃度為5mg·L-1、溫度30℃、pH值為8.0時胞外酶對甲嘧磺隆的降解率最大為86.9%。在LB液體培養(yǎng)基中,當甲嘧磺隆濃度為5mg·L-1、接種量為2.3×107CFU·mL-1、初始pH值為9.0、溫度35℃、轉速為150r·min-1、培養(yǎng)時間72h時JH3菌株胞外粗酶的酶比活最高達到88

8、.4U·mg-1;酶促反應體系的甲嘧磺隆最適濃度為5mg·L-1、溫度35℃、pH值為9.0時胞外酶對甲嘧磺隆的降解率最大為91.3%。兩菌株甲嘧磺隆降解酶在25℃～45℃范圍內熱穩(wěn)定性較好,pU值為7～9堿性條件下能夠保持較高降解活性。
　　 4.JH2、JH3菌株降解甲嘧磺隆活性酶的純化。胞外粗蛋白經過DEAE SepHaroseFast Flow陰離子交換柱分離,在280nm下JH2菌株得到5個蛋白吸收峰,降解圈法檢測發(fā)現(xiàn)

9、3個洗脫峰P1-1、P1-3、P1-5均有降解活性;JH3菌株得到2個蛋白吸收峰,降解圈法檢測發(fā)現(xiàn)僅P2-2洗脫峰具有降解活性;SDS-PAGE電泳檢測P1-1、P1-3、P1-5和P2-2的分子量分別是43kDa、32kDa、15kDa和46kDa。將甲嘧磺隆降解酶P1-1、P1-3、P1-5和P2-2利用生物質譜技術測定了氨基酸序列,得到4種降解酶分別為:信號轉導組氨酸蛋白激酶、預苯酸脫氫酶、未知蛋白和糖基轉移酶。根據(jù)得到的編碼氨基

10、酸的基因序列設計合成了簡并引物,通過PCR分別從JH2、JH3菌株基因組中克隆出甲嘧磺隆降解酶基因G1-1、G1-3、G1-5和G2-2,編碼基因全長分別是1191 bp、886 bp、415 bp、1274 bp;G1-1、G1-3、G1-5和G2-2分別與載體PMD19-Vector連接轉入大腸桿菌,篩選得到陽性克隆并測序,通過Blast軟件分析,所得結果與已測序得到的編碼氨基酸的基因序列基本吻合。
　　 5.降解甲嘧磺隆微

11、生物菌劑加工及應用的研究。本論文初步研制出JH2、JH3菌株的水劑和顆粒劑配方,篩選出了對甲嘧磺隆敏感的植物是小麥,生物活性測定甲嘧磺隆對小麥的IC50值為0.014mg·kg-1。在分別使用JH2和JH3菌株水劑20 d和15 d后能將土壤中甲嘧磺隆濃度為5mg·kg以和1mg·kg-1的殘留降解為對小麥無明顯藥害水平,通過HPLC檢測處理后土壤中的甲嘧磺隆發(fā)現(xiàn),土壤中甲嘧磺隆殘留量小于0.0077mg·kg-1,降解率達到了99%以