堿性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選，產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及其基因組文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、從成都及其附近地區(qū)富含油脂的土壤中采集樣品,利用以橄欖油為主要基質(zhì)的富集培養(yǎng)基培養(yǎng)、以三丁酸甘油酯為主要基質(zhì)的平板初篩和搖瓶復(fù)篩的篩選模型,反復(fù)篩選確定了2株堿性脂肪酶活性較高的菌株(WA和WP).經(jīng)過(guò)形態(tài)觀(guān)察和生理生化特性分析,將WA菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),WP菌株鑒定為火神發(fā)光桿菌(Photobacterium logei).迄今尚未有解淀粉芽孢桿菌能產(chǎn)生堿性脂肪酶的報(bào)道.通

2、過(guò)單因素分析和正交分析法,優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌WA產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件,確定此菌最佳產(chǎn)酶條件為:1.0﹪橄欖油,1﹪淀粉為碳源,2﹪黃豆粉和2﹪玉米粉為氮源,培養(yǎng)基起始pH 7.0,接種量為7﹪,培養(yǎng)溫度為30℃,100mL三角瓶裝量為15mL,180rpm培養(yǎng)72h.在此發(fā)酵條件下,該菌發(fā)酵上清液中酶活可達(dá)12 U/mL.對(duì)發(fā)酵液性質(zhì)進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn),此酶最適反應(yīng)溫度為37℃,最佳反應(yīng)pH為8.5,在pH7.0~10范圍內(nèi)活性穩(wěn)定,并具

3、有一定的熱穩(wěn)定性.10 mmol/LCa<'2+>和K<'+>對(duì)酶有激活作用,而Cu<'2+>和Fe<'3+>則對(duì)該酶有抑制作用.將解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)總DNA經(jīng)Sau3 AI部分酶解后,利用瓊脂糖凝膠回收4~10kbDNA片段,然后與BamHI酶切及脫磷酸化處理過(guò)的pUC19載體連接,以大腸桿菌DH5α為受體,構(gòu)建了解淀粉芽孢桿菌的基因組文庫(kù).該文庫(kù)有5000~6000個(gè)克隆,其中80﹪以上克隆中的