巨噬細(xì)胞活化對(duì)先天性巨結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞及腸道電活動(dòng)的影響.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 人類(lèi)HD結(jié)腸巨噬細(xì)胞分布和活化及ICCs表型改變
　　目的：檢測(cè)HD患兒結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞分布活化及ICCs表型的改變，探討巨噬細(xì)胞在HD腸炎發(fā)病中的作用。
　　方法：收集先天性巨結(jié)腸患兒結(jié)腸遠(yuǎn)段及近段標(biāo)本，行HE染色、評(píng)估各段腸管炎癥損傷程度，CD68和iNOS免疫熒光雙染法評(píng)估M1型巨噬細(xì)胞活化狀況，CD68和Arg-1免疫熒光雙染法評(píng)估M2型巨噬細(xì)胞活化狀況，c-ki

2、t免疫組化染色觀察ICCs表型改變，Western Blot、RT-PCR檢測(cè)各組腸管iNOS、TNF-α、IL-1β、Arg-1、CD34、c-kit的蛋白及mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：HE染色顯示HAEC組結(jié)腸近端擴(kuò)張段粘膜層、粘膜下層有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)腸組織病理評(píng)分顯示HAEC結(jié)腸擴(kuò)張段評(píng)分明顯高于HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段及HD結(jié)腸近段、遠(yuǎn)端。CD68和iNOS免疫熒光雙染可見(jiàn)HAEC組結(jié)腸擴(kuò)張段M1型巨噬細(xì)胞明顯增多，而H

3、AEC組結(jié)腸遠(yuǎn)段及HD組結(jié)腸近段、遠(yuǎn)端未見(jiàn)明顯的M1型巨噬細(xì)胞；CD68和Arg-1免疫熒光雙染可見(jiàn)，與HAEC及HD結(jié)腸近端擴(kuò)張段相比較， M2型巨噬細(xì)胞在HAEC及HD組結(jié)腸遠(yuǎn)段均增加。c-kit免疫組化染色顯示，相對(duì)比HD組結(jié)腸近段，HAEC組結(jié)腸擴(kuò)張段c-kit陽(yáng)性的ICCs明顯減少；而HD及HAEC結(jié)腸遠(yuǎn)段均未見(jiàn)明顯的ICCs表達(dá)。Western Blot顯示HAEC組結(jié)腸擴(kuò)張段iNOS、TNF-α、IL-1β表達(dá)升高，Arg

4、1表達(dá)在HD及HAEC遠(yuǎn)端升高，c-kit表達(dá)在HAEC組結(jié)腸擴(kuò)張段降低（p<0.05），而CD34在各組的表達(dá)變化均不明顯。RT-PCR結(jié)果顯示iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平在HAEC組結(jié)腸擴(kuò)張段明顯升高，同時(shí)c-kit表達(dá)降低（p<0.05)，CD34在各組的表達(dá)變化均不明顯。
　　結(jié)論：HAEC組結(jié)腸近端擴(kuò)張段M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯并且分泌的大量的炎癥因子如TNF-α、IL-1β，同時(shí)ICCs的c-kit

5、表達(dá)明顯降低。
　　第二部分 HD模型小鼠（Ednrb-/-）結(jié)腸巨噬細(xì)胞活化及對(duì)ICCs表型改變和腸道慢波的影響
　　目的：檢測(cè)不同周齡HD模型小鼠（Ednrb-/-）結(jié)腸結(jié)腸組織巨噬細(xì)胞活化及ICCs表型和腸道慢波活動(dòng)的改變，探討巨噬細(xì)胞活化對(duì)ICCs表型改變及腸道慢波活動(dòng)的影響。
　　方法：獲取1w、2w、3w周齡的HD小鼠及野生型小鼠的結(jié)腸標(biāo)本，結(jié)腸HE染色、評(píng)估各段腸管炎癥損傷程度，CD68和iNOS免疫熒光

6、雙染法評(píng)估M1型巨噬細(xì)胞活化狀況，CD68和Arg-1免疫熒光雙染法評(píng)估M2型巨噬細(xì)胞活化狀況，c-kit免疫組化染色觀察ICCs表型改變，Western Blot、RT-PCR檢測(cè)各組腸管iNOS、TNF-α、IL-1β、Arg1、CD34、c-kit的蛋白及mRNA表達(dá)水平，電生理記錄儀檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸慢波活動(dòng)變化。采用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞后再檢測(cè)巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)、ICCs表型及結(jié)腸慢波活動(dòng)。
　　結(jié)果：HE染色顯示3

7、w的HD小鼠結(jié)腸近端擴(kuò)張段有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)腸組織病理評(píng)分顯示3w的HD小鼠結(jié)腸近段評(píng)分明顯高于其結(jié)腸遠(yuǎn)段及1w、2w的HD結(jié)腸近段、遠(yuǎn)端。CD68和iNOS免疫熒光雙染可見(jiàn)3w的HD小鼠結(jié)腸近段M1型巨噬細(xì)胞明顯增多，而其結(jié)腸遠(yuǎn)段及1w、2w的HD小鼠及野生型小鼠結(jié)腸近段、遠(yuǎn)端未見(jiàn)明顯的M1型巨噬細(xì)胞；CD68和Arg1免疫熒光雙染可見(jiàn)，與HD結(jié)腸近段及野生型小鼠相比較，M2型巨噬細(xì)胞在3w的HD小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)段增加。c-kit免疫

8、組化染色顯示，相對(duì)比于1w、2w的HD小鼠及野生型結(jié)腸近段，3w的HD小鼠結(jié)腸近端擴(kuò)張段c-kit陽(yáng)性的ICCs明顯減少；而1w、2w及2w結(jié)腸遠(yuǎn)段均未見(jiàn)明顯的ICCs表達(dá)。Western Blot顯示3w的HD小鼠結(jié)腸近端擴(kuò)張段iNOS、TNF-α、IL-1β表達(dá)升高，Arg1表達(dá)在1w、2w及3w的HD小鼠遠(yuǎn)端升高，c-kit表達(dá)在3w的HD小鼠結(jié)腸擴(kuò)張段降低（p<0.05），而CD34在各組的表達(dá)變化均不明顯。RT-PCR結(jié)果顯示

9、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平在HAEC組結(jié)腸擴(kuò)張段明顯升高，同時(shí)c-kit表達(dá)降低（p<0.05)，CD34在各組的表達(dá)變化均不明顯。電生理記錄儀顯示，1w、2w的HD小鼠腸道慢波振幅降低，但存在正常的節(jié)律及頻率；而3w的HD小鼠結(jié)腸慢波紊亂、破壞。氯膦酸二鈉脂質(zhì)體處理后，3w的HD小鼠結(jié)腸近段未見(jiàn)明顯的炎癥損傷，CD68及iNOS的免疫熒光雙染未見(jiàn)明顯的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見(jiàn)c-kit陽(yáng)性的ICCs，腸道慢波活動(dòng)

10、有所恢復(fù)。
　　結(jié)論：HAEC結(jié)腸擴(kuò)張段M1型巨噬細(xì)胞活化及分泌的炎癥因子改變ICCs的表型進(jìn)而抑制腸道慢波活動(dòng)。
　　第三部分 TNF-α對(duì)腸道ICCs表型及起搏電流的影響
　　目的：提取小鼠結(jié)腸ICCs，TNF-α刺激后檢測(cè)ICCs表型及起搏電流的變化。
　　方法：采用酶消化法提取3周齡野生型小鼠的ICCs，培養(yǎng)3天后實(shí)驗(yàn)組加入10ng/ml的TNF-α共培養(yǎng)，對(duì)照組加入等量的生理鹽水，再培養(yǎng)24小時(shí)后，采用

11、CD34及c-kit免疫熒光雙染法檢測(cè)ICCs表型改變，RT-PCR法檢測(cè)CD34、c-kit及與起搏電流相關(guān)的基因如Ryr3、Itpr3、Calm1、TRPC4、Ano1、DIG2、DIG4表達(dá)，膜片鉗技術(shù)記錄全細(xì)胞起搏電流變化。
　　結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組ICCs單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞網(wǎng)格間的突觸數(shù)量減少；免疫熒光染色可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組c-kit表達(dá)明顯減少，而CD34未見(jiàn)明顯變化；RT-PCR結(jié)果顯示CD34的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而

12、c-kit的表達(dá)明顯降低，同時(shí)Ryr3、Itpr3、TRPC4、Ano1的表達(dá)也下調(diào)，但Calm1、DIG2、DIG4的表達(dá)無(wú)明顯改變；膜片鉗記錄ICCs起搏電流顯示，實(shí)驗(yàn)組起搏電流幅度明顯降低。
　　結(jié)論：TNF-α能抑制ICCs的c-kit及其下游與起搏電流相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制ICCs起搏電流的幅度。
　　第四部分 LPS誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)腸炎中ICCs表型改變及其機(jī)制研究
　　目的：探討LPS誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)腸炎中，m

13、iR221表達(dá)及對(duì)Cajal表型改變和腸道蠕動(dòng)功能的影響。
　　方法：對(duì)照組采用egg water飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組自斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的48hpf至11dpf使用不同濃度LPS（1、10、50μg/ml）配制的egg water持續(xù)喂養(yǎng)。收集3dpf、5dpf、7dpf，11dpf時(shí)間段的斑馬魚(yú)標(biāo)本。HE染色評(píng)估腸道組織炎癥損傷程度，RT-PCR檢測(cè)斑馬魚(yú)組織miR221表達(dá)，Western Blot及RT-PCR檢測(cè)TNF-α、c-ki

14、t蛋白及mRNA的表達(dá)，whole-mount制備組織免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)腸道c-kit表達(dá)，熒光示蹤劑法檢測(cè)斑馬魚(yú)腸道傳輸速率。自斑馬魚(yú)受精卵的0.2-1h內(nèi)，顯微注射嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸鏈抑制miR221（MO-miR221）及錯(cuò)配的嗎啡啉修飾的寡核苷酸鏈（Mismatch-MO），按上述方法用LPS刺激斑馬魚(yú)，收集不同時(shí)間點(diǎn)斑馬魚(yú)標(biāo)本，檢測(cè)c-kit表達(dá)及斑馬魚(yú)腸道傳輸速率。
　　結(jié)果：HE染色顯示

15、，LPS刺激后，3dpf、5dpf、7dpf、11dpf的斑馬魚(yú)腸道組織均有不同程度的炎癥損傷，并且LPS濃度越高，腸道炎癥損傷越為明顯。Western Blot檢測(cè)TNF-α蛋白水平顯示，3dpf，5dpf，7dpf，11dpf組其表達(dá)水平隨LPS濃度增加而表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)（P<0.05），并且呈現(xiàn)LPS濃度依耐性；而kita的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P<0.05）。RT-PCR檢測(cè)TNF-α的mRNA表達(dá)顯示，各時(shí)間段其表達(dá)水平隨LPS濃

16、度增加而表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)（P<0.05）；而kita的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P<0.05）。免疫熒光染色顯示，3dpf，5dpf各組未見(jiàn)明顯的c-kit表達(dá)，而7dpf，11dpf組c-kit表達(dá)水平隨著LPS濃度的增加而下降。熒光示蹤劑檢測(cè)腸道傳輸速率顯示，7dpf，11dpf組腸道傳輸速率隨著LPS濃度的增加而下降。Targetscan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR221能夠與kita互補(bǔ)進(jìn)而抑制其表達(dá)，同時(shí)RT-PCR檢測(cè)miR221發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水

17、平隨著LPS濃度增加而升高。分別顯微注射 Mismatch-Mo和 miR221-MO后， RT-PCR證實(shí)miR221-MO組LPS刺激后3dpf、5dpf、7dpf時(shí)能有效抑制miR221的表達(dá)（P<0.05）；同時(shí)用 RT-PCR檢測(cè)3dpf、5dpf、7dpf時(shí)斑馬魚(yú) kita的 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與Mismatch-MO相比較，LPS刺激后miR221-MO組kita表達(dá)水平較高（P<0.05），免疫熒光染色染色發(fā)現(xiàn)miR22