藥物誘導(dǎo)肝臟損傷的免疫學(xué)機(jī)制及人源化小鼠中B細(xì)胞特性研究.pdf

1、對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是解熱鎮(zhèn)痛常用的一種非處方藥物，但是該藥物過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致急性的肝臟衰竭，嚴(yán)重的會(huì)造成人的死亡。在美國(guó)，APAP的過(guò)量使用已經(jīng)給公共健康系統(tǒng)造成沉重負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，由于HBV的感染，患肝臟疾病的人更多，此藥的過(guò)量使用對(duì)這些人的危害更大。
　　 APAP在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)被細(xì)胞色素P450同工酶CYP2E1(cytochromep450CYP2E1)代謝轉(zhuǎn)化成有毒性的自由基代謝產(chǎn)物N-乙

2、酰-對(duì)-苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinoneimine，NAPQI)，胞內(nèi)的谷胱甘肽（glutathione，GSH）可以與之結(jié)合將其解毒，但是過(guò)量的NAPQI會(huì)耗盡還原型谷胱甘肽，從而和其他蛋白的半胱氨酸殘基結(jié)合，接著就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體異常和DNA損傷，最終造成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死。但是藥物直接介導(dǎo)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死只是占整個(gè)肝臟損傷的一小部分，因?yàn)楦螌?shí)質(zhì)細(xì)胞壞死后活化了肝臟內(nèi)的天然免疫應(yīng)答，它們掀起了對(duì)肝臟的第

3、二波沖擊，而且由后者造成的肝臟損傷遠(yuǎn)甚過(guò)藥物直接導(dǎo)致的損傷。在天然免疫介導(dǎo)的損傷中，有許多免疫細(xì)胞參與，包括自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercells，NK)、巨噬細(xì)胞(macrophages)、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendrticcells，DC)、中性粒細(xì)胞(neutrophils)。其中中性粒細(xì)胞備受關(guān)注，因?yàn)锳PAP處理后有大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到肝臟中。但是，這些中性粒細(xì)胞是如何浸潤(rùn)到肝臟以及觸發(fā)了這一反應(yīng)的起因和過(guò)程到目前還沒(méi)

4、有研究清楚。
　　 在本文的研究中，我們用過(guò)量的APAP處理小鼠，誘導(dǎo)出肝臟的急性損傷，通過(guò)病理學(xué)染色和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase，ALT)水平檢測(cè)確定肝臟的損傷水平，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法確定肝臟中各種免疫細(xì)胞的變化，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法確定細(xì)胞因子的變化，通過(guò)細(xì)胞清除和細(xì)胞因子中和的方法確定它們?cè)隗w內(nèi)的功能，同時(shí)也通過(guò)體外的細(xì)胞培養(yǎng)刺激確定細(xì)胞的特性變化。通過(guò)以上的的研究方法，我們?nèi)〉玫?/p>

5、主要結(jié)果如下:
　　 1、過(guò)量的APAP處理會(huì)造成肝臟的急性損傷和中性粒細(xì)胞在肝臟的聚集
　　 通過(guò)檢測(cè)ALT水平，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)量的APAP注射后會(huì)使得肝臟迅速發(fā)生損傷，24小時(shí)(hours，hr)達(dá)到最高，病理染色也顯示肝臟組織中有大片的壞死區(qū)域。同時(shí)肝臟的單個(gè)核細(xì)胞顯著增加，而增加的部分主要是中性粒細(xì)胞。
　　 2、中性粒細(xì)胞的招募依賴于IL-17A
　　 通過(guò)檢測(cè)血清中和肝臟組織中的細(xì)胞因子水平，我們

6、發(fā)現(xiàn)IL-17A顯著增加。用中和抗體阻斷了IL-17A的功能后，小鼠肝臟中的中性粒細(xì)胞明顯減少，同時(shí)肝臟損傷和小鼠的死亡率都降低。
　　 3、γδT細(xì)胞是IL-17A的主要來(lái)源
　　 通過(guò)流式檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，肝臟中IL-17A+γδT細(xì)胞的比例明顯增加，清除γδT細(xì)胞后，血清中IL-17A明顯減少。而清除CD4+T細(xì)胞和NK1.1+細(xì)胞，IL-17A的水平卻沒(méi)有減少。清除γδT細(xì)胞也顯著降低肝臟的損傷和小鼠的死亡率。另外

7、，肝臟中的中性粒細(xì)胞明顯減少。我們也發(fā)現(xiàn)，在APAP處理后，γδTCR(-/-)小鼠肝臟中的中性粒細(xì)胞比正常的C57BL/6肝臟中的中性粒細(xì)胞顯著減少。
　　 4、IL-23刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A
　　 那么γδT細(xì)胞是在什么條件下分泌IL-17A的？研究發(fā)現(xiàn)，APAP處理后血清中和肝臟組織中IL-23顯著增加。當(dāng)用中和抗體阻斷IL-23的作用時(shí)，血清中IL-17A的水平明顯降低，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在IL-23p4

8、0(-/-)小鼠中。而且IL-23缺失情況下肝臟中性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，IL-23單獨(dú)刺激就可以誘導(dǎo)γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A。
　　 5、HMGB1通過(guò)TLR4途徑刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-23
　　 那么IL-23又是從何處而來(lái)？研究發(fā)現(xiàn)，抑制巨噬細(xì)胞的活性后，IL-23和IL-17A的水平都明顯下降。而APAP處理后，HMGB1顯著增加。當(dāng)用特異性抑制劑抑制HMGB1的作用后，IL-23

9、和IL-17A則明顯減少，而且中性粒細(xì)胞在肝臟中的數(shù)量也減少。在體外用HMGB1刺激TLR4(+/+)巨噬細(xì)胞可以使其產(chǎn)生IL-23，但是TLR4(-/-)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-23卻低很多。同時(shí)，APAP處理TLR4(-/-)小鼠后，其血清中的IL-23和IL-17A的含量顯著低于C57BL/6小鼠中的含量。
　　 結(jié)論:巨噬細(xì)胞和γδT細(xì)胞之間的相互作用在APAP誘導(dǎo)的組織損傷而造成的急性肝炎中發(fā)揮了重要的作用。APAP引起