2型糖尿病大鼠胃旁路手術(shù)后GLP-1變化對(duì)血糖控制和胰島細(xì)胞凋亡調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、前言:2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)是由環(huán)境、基因及內(nèi)分泌因素引起的一種病理狀態(tài)。2006年世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)調(diào)查結(jié)果顯示，從1996年至2006年10年內(nèi)，T2DM患者數(shù)量由3000萬迅速增至1.7億，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)3.66億。T2DM數(shù)量以驚人的速度增長，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的公共健康問題。除了人口老齡化，近年來世界上許多地區(qū)肥胖人口

2、數(shù)量的急劇增加，是導(dǎo)致T2DM以驚人速度增長的重要原因。中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)最新調(diào)查顯示：由于中國經(jīng)濟(jì)改善以及國人生活習(xí)慣的改變，T2DM發(fā)病率明顯上升，已成為威脅國人健康的第一大疾病。T2DM患者長期處于高血糖狀態(tài)，可引起多系統(tǒng)損害，如冠心病、缺血性或出血性腦血管疾病、腎動(dòng)脈硬化、肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥，引起功能缺陷及衰竭。病情嚴(yán)重或應(yīng)激時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂，降低了生活質(zhì)量，健康和生命安全受到嚴(yán)重威脅。多年來對(duì)于T2DM的臨床治療一直采用

3、傳統(tǒng)的保守治療，包括藥物刺激胰島細(xì)胞分泌及胰島素替代療法。然而，美國一項(xiàng)研究表明：藥物治療和胰島素替代療法不能延緩T2DM患者并發(fā)癥的出現(xiàn)及改善預(yù)后。近些年來，移植外科一直致力于通過胰腺移植解決T2DM患者胰島細(xì)胞功能衰竭的問題。這一方法療效與胰島素替代療法類似，都存在胰島素抵抗逐漸加重和胰島素分泌相對(duì)不足的問題。而且，移植的各種并發(fā)癥常使胰島細(xì)胞的功能受到影響，因而實(shí)際效果不佳。因此，探求T2DM的有效治療方案是亟待解決的科學(xué)問題。<

4、br>　　 近些年來，減肥外科醫(yī)生進(jìn)行減肥手術(shù)時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)：接受胃旁路(Roux-en-Ygastric bypass，RYGB)手術(shù)的合并T2DM的肥胖病人，術(shù)后血糖降至正常，并能長期維持。美國減肥外科醫(yī)生Walter Pories于1980年首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了這一現(xiàn)象。目前，臨床上大量報(bào)道都支持RYGB手術(shù)對(duì)T2DM的治療作用。因?yàn)樵谛g(shù)后體重明顯下降之前，數(shù)天內(nèi)血糖即降至正常范圍，提示血糖的控制是胃旁路手術(shù)本身的作用，而非肥胖相關(guān)代謝

5、異常緩解的結(jié)果。同期研究還發(fā)現(xiàn)：由于RYGB手術(shù)改變正常消化道結(jié)構(gòu)，術(shù)后一些胃腸激素分泌發(fā)生變化，進(jìn)而推測T2DM的緩解可能與手術(shù)后胃腸激素的變化有關(guān)。其中，胰高血糖素樣肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)可能是重要的調(diào)節(jié)因子之一。GLP-1主要由末段回腸內(nèi)分泌L細(xì)胞受食物刺激后分泌，分泌后有選擇地作用于組織，調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)。然而，GLP-1的確切作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究采用先天性T2DM大鼠Goto-Ka

6、kizaki(GK)和大鼠胰島β細(xì)胞系RIN-m5F，通過手術(shù)建立GK大鼠RYGB手術(shù)模型，探討RYGB手術(shù)后GLP-1的變化及其對(duì)糖尿病控制和抗胰島β細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，進(jìn)而明確RYGB治療T2DM的機(jī)理，為外科手術(shù)治療T2DM提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器
　　 8周齡SPF級(jí)雄性GK大鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。周齡、性別匹配的Wistar大鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛

7、京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠胰島β細(xì)胞系RIN-m5F購自美國國立細(xì)胞庫(American Type Culture Collection，ATCC)。10％水合氯醛；RPMI1640培養(yǎng)基；exendin-4；抑肽酶；胰蛋白酶；二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidase-4，DPP-4)；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)；大鼠GLP-1R、Ki-67、bcl-2、bax、

8、caspase-3抗體；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)試劑盒；大鼠GLP-1 ELISA試劑盒等。
　　 顯微手術(shù)器械，細(xì)胞培養(yǎng)工作臺(tái)，SANYO MDF-U-80℃冰箱，OLYMPUSAX70倒置顯微鏡，GFL THERMOLAB振蕩水浴箱，高速冷凍離心機(jī)，電泳儀，半干轉(zhuǎn)印

9、儀，電子天平，微量泵，PH計(jì)，血糖儀及血糖試紙等。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)實(shí)驗(yàn)分組及處理GK大鼠30只，Wistar大鼠10只分為以下四組：
　　 1、RYGB組：GK大鼠10只。賁門處橫斷，遠(yuǎn)斷端結(jié)扎閉鎖。距Treitz韌帶10 cm橫斷空腸，遠(yuǎn)端腸袢經(jīng)結(jié)腸前上提與食管斷端吻合，近端腸袢在食管空腸吻合口遠(yuǎn)側(cè)10 cm處與遠(yuǎn)端腸袢行空腸間側(cè)側(cè)吻合。曠置胃、十二指腸和上段10cm空腸。
　　 2、

10、假手術(shù)(sham operation，SO)組：GK大鼠10只。在賁門處切斷后再吻合，距Treitz韌帶10 cm處切斷空腸后原位端端吻合，未改變胃腸道正常解剖結(jié)構(gòu)。
　　 3、節(jié)食組：GK大鼠10只。按每日正常食量的1/3喂養(yǎng)。
　　 4、對(duì)照組：Wistar大鼠10只，作為非糖尿病正常對(duì)照。
　　 在第一部分，檢測手術(shù)前后大鼠體重、攝食率、空腹血糖(fasting blood sugar，F(xiàn)BS)、口服葡萄糖

11、耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)、血漿胰島素以及胰島素抵抗的變化，探討RYGB手術(shù)對(duì)2型糖尿病GK大鼠葡萄糖代謝的影響。
　　 在第二部分，檢測手術(shù)前后大鼠血漿GLP-1的變化以及胰腺組織GLP-1受體表達(dá)的變化，探討RYGB手術(shù)改善2型糖尿病GK大鼠葡萄糖代謝的可能機(jī)制。
　　 在第三部分，通過體外實(shí)驗(yàn)，檢測GLP-1受激動(dòng)劑exendin-4對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞RIN-m5F胰

12、島素分泌的影響，并通過檢測Ki-67、bcl-2、bax、caspase-3等蛋白表達(dá)，探討exendin-4對(duì)RIN-m5F凋亡調(diào)控的影響及機(jī)制。
　　 (二)檢測方法
　　 1、電子稱測量體重及攝食量，計(jì)算攝食率。攝食率=24小時(shí)攝食量(g)/體重(Kg)。
　　 2、血糖儀法檢測空腹血糖(FBS)和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。
　　 3、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法檢測血漿胰島素和GLP-1

13、水平。
　　 4、免疫蛋白印跡雜交(Western blot)檢測胰腺組織GLP-1受體蛋白表達(dá)，RIN-m5F細(xì)胞GLP-1受體以及Ki-67、bcl-2、bax和caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　 (三)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05差異具有顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 一、RYGB手術(shù)對(duì)GK大鼠血糖控制和胰島素分泌的影響

14、術(shù)后RYGB組、假手術(shù)組和節(jié)食組體重及攝食率均下降。術(shù)后第4周，以節(jié)食組體重和攝食率下降最為顯著。RYGB組與假手術(shù)組和節(jié)食組相比較，手術(shù)后FBS水平明顯著降低(P<0.01)，術(shù)后第2～4周，RYGB組與對(duì)照組比較，F(xiàn)BS水平無顯著差異。與假手術(shù)組和節(jié)食組比較，RYGB組術(shù)后基礎(chǔ)血漿胰島素水平顯著降低(P<0.05)，葡萄糖灌胃后30 min血漿胰島素水平明顯升高(P<0.05)。術(shù)后第3周時(shí)，RYGB組與假手術(shù)組和節(jié)食組相比，OGT

15、T顯著改善，胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR(Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance)值明顯下降；RYGB組與對(duì)照組相比，基礎(chǔ)及葡萄糖灌胃后血漿胰島素水平無顯著差異。
　　 二、RYGB手術(shù)對(duì)GK大鼠血漿GLP-1水平及胰腺組織中GLP-1受體表達(dá)的影響手術(shù)前RYGB組、假手術(shù)組和節(jié)食組血漿GLP-1水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。手術(shù)后RYGB組血漿GLP-1水平逐漸升

16、高，與假手術(shù)組和節(jié)食組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RYGB組血漿GLP-1水平在術(shù)后第3周時(shí)與對(duì)照組相比較無顯著差異，在術(shù)后第4周時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。假手術(shù)組和節(jié)食組血漿GLP-1水平術(shù)后仍在較低水平波動(dòng)，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。RYGB組GLP-1R蛋白表達(dá)活性顯著上調(diào)，顯著高于假手術(shù)組和節(jié)食組GLP-1R蛋白表達(dá)水平(P均<0.05)。而假手術(shù)組和節(jié)食組GLP-1R表達(dá)水平則顯著低于對(duì)照組(P均<

17、0.05)。
　　 三、Exendin-4對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞RIN-m5F功能及凋亡的影響高糖組RIN-m5F細(xì)胞中GLP-1R蛋白表達(dá)活性降低，與對(duì)照組相比較，差異有顯著性(P<0.05)。GLP-1R激動(dòng)劑exendixi-4能促進(jìn)RIN-m5F細(xì)胞分泌胰島素，且隨著exendin-4濃度的增加，胰島素的分泌量呈上升趨勢。exendin-4組Ki-67蛋白表達(dá)活性為68.8±11.1，對(duì)照組Ki-67表達(dá)活性為24.5±6.6

18、，二者相比較，差異有顯著性(P<0.05)。在exendin-4組與對(duì)照組中，bcl-2蛋白表達(dá)活性分別為146.4±19.8和99.2±22.3，bax蛋白表達(dá)活性分別為45.0±15.9和113.1±23.9，bcl-2/bax比值分別為3.2±0.4和0.8±0.2，caspase-3蛋白表達(dá)活性分別為35.9±9.6和86.1±5.9。exendin-4組bcl-2表達(dá)顯著高于對(duì)照組，bax和caspase-3表達(dá)顯著低于對(duì)照組

19、，bcl-2/bax顯著高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:
　　 1、RYGB手術(shù)對(duì)GK大鼠的2型糖尿病具有明顯的治療作用。
　　 2、GK大鼠2型糖尿病緩解與術(shù)后食物攝入減少及體重變化無明顯關(guān)系。
　　 3、胃旁路手術(shù)增加GK大鼠血漿GLP-1水平。
　　 4、胃旁路手術(shù)后GK大鼠胰腺組織GLP-1受體表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　 5、GLP-1通過受體對(duì)胰島β細(xì)胞調(diào)控，可能是術(shù)后2型糖尿病緩解的重