干酪乳桿菌Lc18錳超氧化物歧化酶基因的克隆和異源表達(dá).pdf

1、乳桿菌是人和動物體內(nèi)十分重要的益生菌群之一,肩負(fù)著許多重要的生理作用,其中包括對宿主的抗氧化效應(yīng)。益生菌產(chǎn)品也得到了越來越廣泛的研究和應(yīng)用。其中益生菌的抗氧化性能是最重要的益生指標(biāo)之一,具有重要的研究價值。乳桿菌有許多種抗氧化的機(jī)理,如超氧化物歧化酶(SODs),過氧化氫酶以及細(xì)胞內(nèi)高濃度的金屬離子等等。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)清除活性氧自由基的一種重要酶類,是生物體抗氧化能力的一個重要依據(jù)。目前,許多生物體內(nèi)的sod基因都得到了廣泛的

2、研究,并在各種載體中完成了異源表達(dá)。但迄今為止,乳桿菌中的sod基因仍然尚未有人研究。據(jù)之前的研究報道,大部分的乳桿菌中都不含sod基因,僅有兩株乳桿菌(干酪乳桿菌和米酒乳桿菌)在經(jīng)過全基因組測序后,從生物信息學(xué)的角度判斷其可能含有sod基因,但至今還沒有人將乳桿菌中可能含有的sod基因進(jìn)行克隆和異源表達(dá),從實(shí)驗(yàn)上加以證明。在本研究中,我們首先對6株乳桿菌進(jìn)行了抗氧化能力的評價,首先選取抗氧化能力最佳的干酪乳桿菌Lc2作為sod基因供體

3、,但經(jīng)過反復(fù)PCR均未產(chǎn)生特異性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中所使用的引物均是根據(jù)已經(jīng)全測序的標(biāo)準(zhǔn)菌株干酪乳桿菌ATCC 334的序列進(jìn)行設(shè)計(jì),而Lc2的sod基因在進(jìn)化過程中與標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生了較大的差異；或其基因組根本不含sod基因,而其仍能保持較高的抗氧化水平可能是由于體內(nèi)具有較高的金屬離子濃度或其他機(jī)理。之后我們以干酪乳桿菌Lc18為材料,根據(jù)干酪乳桿菌ATCC 334的全測序結(jié)果,設(shè)計(jì)引物并摸索出了適宜的擴(kuò)增條件,成功獲得了干酪乳桿菌Lc18的so

4、d基因,并利用pET表達(dá)系統(tǒng),將目的片段雙酶切,連接pET-28a(+)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5α擴(kuò)增重組質(zhì)粒,并將提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌。經(jīng)過重組菌液PCR檢驗(yàn)及重組質(zhì)粒酶切檢驗(yàn),證明目的片段已經(jīng)插入pET-28a(+)質(zhì)粒中,且成功轉(zhuǎn)入宿主菌內(nèi)。最后,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo),通過重組菌粗蛋白提取液SDS-PAGE電泳,我們在目標(biāo)位置得到了條帶,初步說明重組質(zhì)粒在宿主菌中得到了表達(dá)。隨后,我們使用Ni-NTA系統(tǒng)對粗蛋白進(jìn)行親和純

5、化,得到目標(biāo)蛋白SOD,使用SDS-PAGE進(jìn)行檢驗(yàn)得到單一的目標(biāo)條帶,并測得純化蛋白酶的活性為39.97 U/mg。我們對重組菌進(jìn)行了氧化性評價,其氧化性有一定的提高,尤其是超氧陰離子清除率和過氧化氫清除率。而提高的程度并不高,可能是由于宿主菌E. coli BL21(DE3)本身亦含有SOD蛋白,導(dǎo)致本底水平較高的緣故。而同時我們也發(fā)現(xiàn)粗蛋白提取液的抗氧化性普遍高于完整細(xì)胞的抗氧化性,這一發(fā)現(xiàn)與Saide和Gilliland之前所發(fā)

6、表的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)一致?？赡艿脑蚴前|(zhì)中抗氧化酶類或物質(zhì)能更好的接近氧化底物。此外我們通過N端氨基酸序列分析,判斷該SOD蛋白為含有金屬離子錳的超氧化物歧化酶。本文是首篇將乳桿菌中的sod基因擴(kuò)增出來并進(jìn)行原核異源表達(dá)的研究。通過未經(jīng)全測序的干酪乳桿菌Lc18菌株的sod基因在大腸桿菌中的原核表達(dá),首次從乳桿菌屬中克隆出sod基因,直接證明了干酪乳桿菌Lc18中存在sod基因。證明了該sod基因能夠異源表達(dá)并能在異源生物中產(chǎn)生活性,純化分