JNK在新生大鼠高氧肺損傷急性期的表達(dá)及鹽酸右美托咪啶對其表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 1.建立新生大鼠高氧肺損傷模型；2.了解高氧肺損傷急性期肺組織中c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)、TNF-α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況，以及在不同的時間點(diǎn)是否有差異?3.觀察鹽酸右美托咪啶對高氧肺損傷急性期JNK、TNF-α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是否有影響?對高氧肺損傷急性期炎癥反應(yīng)是否有影響?
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物分組及動物模型建立：
　　 72只3-5天左右的新生Sprague Dawley

2、(SD)大鼠隨機(jī)分為4組：
　　 空氣對照組(Ⅰ)；高氧組(Ⅱ)；高氧+10倍臨床劑量鹽酸右美托咪啶(Dexmedetomidine)(Ⅲ)組；高氧+臨床劑量鹽酸右美托咪啶(Ⅳ)組，每組18只。再按實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)1、3、7天分為三個亞組，每個亞組6只。Ⅰ組置于空氣中，其它三組置于高氧箱中，保持箱內(nèi)氧氣濃度在90-95％之間；Ⅲ組和Ⅳ組每天于同一時間點(diǎn)從腹腔注射藥物鹽酸右美托咪啶(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，前者劑量為5μg/kg，后

3、者劑量為0.5μg/kg。
　　 2.標(biāo)本采集
　　 于設(shè)定的時間點(diǎn)分別對四組實(shí)驗(yàn)動物采取斷頭法處死，打開胸腔迅速取出肺組織備檢，其中左肺主要用于病理切片的組織學(xué)檢測和細(xì)胞凋亡指數(shù)的檢測；右肺組織用于JNK、TNF-αmRNA及其蛋白產(chǎn)物的檢測，以及肺濕/干重比的檢測。
　　 3.病理學(xué)觀測：
　　 取左肺用于固定、包埋、病理切片，用于常規(guī)HE染色，觀察肺組織病理學(xué)變化，并拍照存檔。
　　 4.肺

4、濕/干重比檢測：
　　 取部分右肺組織稱量后置于烤箱中測肺濕/干重比。
　　 5.細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測：
　　 取上述病理切片，用TUNEL法檢測肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)，胞核呈現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞.每張切片隨機(jī)選5個高倍鏡(×400)非重疊視野，記數(shù)每個視野的凋亡指數(shù)(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％)。
　　 6.JNK、TNF-α蛋白檢測(Western Blot法)：
　　 取少量大鼠右肺，雙蒸水沈去血

5、，濾紙吸干，-80℃凍存，提取總蛋白后以WesternBlot法檢測NK、TNF-α蛋白的量，并分別與空氣對照組比較。
　　 7.JNK、TNF-αmRNA檢測(RT-PCR方法)：
　　 肺組織總RNA提取后，以RT-PCR方法檢測JNK、TNF-α mRNA，并分別與空氣對照組比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.一般情況
　　 Ⅰ組實(shí)驗(yàn)動物精神狀態(tài)佳、活動靈活，呼吸平穩(wěn)，，體重增長穩(wěn)定。Ⅱ組實(shí)驗(yàn)動

6、物精神狀態(tài)差、行為遲鈍、活動少，呼吸急促，體重增長差。Ⅲ組實(shí)驗(yàn)動物精神狀態(tài)尚佳、活動尚靈活，呼吸稍促，體重增長尚理想，但不如空氣組。Ⅳ組實(shí)驗(yàn)動物精神欠佳，呼吸促，活動不靈活，體重增長欠佳。
　　 2.肺組織病理觀察
　　 2.1大體觀察
　　 Ⅰ組兩肺色澤紅潤，富有彈性，質(zhì)軟；Ⅱ組兩肺蒼白水腫，部分肺葉有出血，質(zhì)地較韌。Ⅳ組同Ⅱ組相比變化不明顯；Ⅲ組兩肺在充血水腫的基礎(chǔ)上有少許蒼白水腫，少許肺葉出血，質(zhì)地中。

7、r>　　 2.2肺組織病理切片
　　 Ⅰ組肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小較均勻，肺泡間隔增多、變薄，肺泡數(shù)目多；Ⅱ、Ⅳ組肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡體積增大、間隔增寬，肺間隔斷裂，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血明顯，炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)可見較多的粉色滲出液。Ⅲ組光鏡下病理組織學(xué)改變介于Ⅰ組和Ⅱ組之間。
　　 3.肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化：
　　 實(shí)驗(yàn)3d、7d時，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均較Ⅰ組明顯升高(P<0.

8、05)，但Ⅲ組較Ⅱ、Ⅳ組低(P<0.05)；Ⅳ組與Ⅱ組差異不大(P>0.05)。
　　 4.肺組織濕干重比值(W/D)：
　　 實(shí)驗(yàn)1d時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組W/D無明顯差異(P>0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)3d、7d時Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組W/D均較Ⅰ組明顯升高(P<0.05)但Ⅲ組較Ⅱ、Ⅳ組低(P<0.05)；Ⅳ組與Ⅱ組差異不大(P>0.05)。
　　 5.JNK、TNF-αmRNA及其蛋白產(chǎn)物在各組肺組織中的表達(dá)：

9、
　　 5.1 TNF-αmRNA及蛋白變化：
　　 實(shí)驗(yàn)1d、3d、7d時Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺組織中TNF-αmRNA和蛋白均較Ⅰ組明顯升高(P<0.05)，且隨時間的延長增高趨勢加大；但Ⅲ組較Ⅱ、Ⅳ組低(P<0.05)；Ⅳ組與Ⅱ組差異不大(P>0.05)。
　　 5.2 JNK mRNA及蛋白變化：
　　 實(shí)驗(yàn)1d、3d、7d時Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺組織中JNK mRNA和蛋白均較Ⅰ組明顯升高(P<0.05)，且隨

10、時間的延長增高趨勢加大；但Ⅲ組較Ⅱ、Ⅳ組低(P<0.05)；Ⅳ組與Ⅱ組差異不大(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.長期的吸入高濃度氧能導(dǎo)致新生大鼠的急性肺損傷，病理表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，肺泡上皮細(xì)胞腫脹，肺泡間質(zhì)腫脹，炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主，肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡體積增大、間隔增寬，較多的肺間隔斷裂，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)可見較多的粉色滲出液。
　　 2.JNK、TNF-α蛋白和mRNA在新