神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和凋亡的影響及與Wnt-β-catenin信號(hào)通路相關(guān)性研究.pdf

1、多種原因造成的骨折、骨延遲愈合和骨不愈合等是目前創(chuàng)傷骨科臨床常見疾病，其治療始終是骨科領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。骨折愈合包含著機(jī)體各系統(tǒng)、多種組織、細(xì)胞因子之間錯(cuò)綜復(fù)雜的協(xié)同作用。近年來越來越多文獻(xiàn)證實(shí)神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)在此過程中扮演著重要角色，通過多種途徑影響骨組織的發(fā)育、形成及代謝。
　　神經(jīng)肽Y是含量最豐富的神經(jīng)肽之一，廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，由36個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。神經(jīng)肽Y

2、表現(xiàn)出非常重要但仍很少了解的調(diào)節(jié)信號(hào)功能，神經(jīng)肽Y主要通過作用于五種G蛋白偶聯(lián)受體(Y1，Y2，Y4，Y5和Y6)發(fā)揮其生物學(xué)作用，其中Y1、Y2受體與成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、增殖等密切相關(guān)，但對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)的增殖和凋亡的作用并不清楚且作用機(jī)制不明確。已有文獻(xiàn)證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成、重建及修復(fù)等過程中起著極為重要的作用，激活Wnt/β-cateni

3、n信號(hào)通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和改善細(xì)胞存活。因此，進(jìn)一步研究了解神經(jīng)肽Y對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，以及在此過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用，有助于明確神經(jīng)肽在骨代謝過程中的作用機(jī)理。
　　本研究通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，培養(yǎng)至第三代，采用流式鑒定法鑒定其純度，以高純度的BMSCs為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為六組，對(duì)照組（加入等量PBS），NPY（10-12mol/L）組，

4、NPY(10-10mol/L)組，NPY(10-8mol/L)組，NPY（最佳效應(yīng)濃度）+NPYY1受體拮抗劑組PD160170（1μM）組以及NPY（最佳效應(yīng)濃度）+Wnt通路拮抗劑DKK1（0.2μg/mL）組，對(duì)于NPY對(duì)BMCs增殖影響研究部分，細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基（10％胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)1％青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)1，3，5,7天，而對(duì)于NPY對(duì)BMCs凋亡影響研究部分，細(xì)胞采用去血清培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)1％青鏈霉

5、素混合液的DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)12h或24h，通過Brdu細(xì)胞增殖試驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況、細(xì)胞流式技術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期和凋亡情況，q-PCR和Western blot檢測增殖、凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果提示NPY可促進(jìn)BMSCs的增殖，并呈現(xiàn)出時(shí)間-濃度依賴性，最大效應(yīng)濃度為10-10M，以NPY刺激后5，7天更為明顯。此外，NPY顯著提高細(xì)胞

6、S和G2/M期的百分比，可提高Cyclin D1mRNA的表達(dá)并降低P53mRNA的表達(dá)。NPY可明顯降低BMSCs去血清培養(yǎng)24h后的細(xì)胞凋亡，顯示出保護(hù)作用，以10-12M濃度最為明顯;同時(shí)細(xì)胞流式結(jié)果提示NPY可明顯降低BMSCs去血清培養(yǎng)24后細(xì)胞早期和中期凋亡率，q-PCR提示NPY可明顯降低凋亡基因caspase-3、caspase-9和Bax的mRNA表達(dá)水平。對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在

7、完全培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)下第3，5，7天后，10-10M NPY可明顯促進(jìn)C-myc、β-catenin mNRA和C-myc、β-catenin、p-GSK-3β蛋白的表達(dá)，同時(shí)在去血清凋亡24h后，NPY可明顯促進(jìn)C-myc、β-catenin、p-GSK-3β蛋白的表達(dá)，NPY的增殖和抗凋亡作用被Y1受體拮抗劑PD160170或Wnt通路拮抗劑DKK1部分阻斷，且可同時(shí)部分阻斷NPY對(duì)β-catenin，p-GSK-3β和c-myc的m