胞內(nèi)形式OPN通過穩(wěn)定TRAF3正向調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng).pdf

1、固有免疫系統(tǒng)作為機體抵御外界病原體入侵的首道防線，不僅可以激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，同時也可以直接對入侵的病原體產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答，從而殺傷病原體。在病毒入侵時，固有免疫系統(tǒng)可以激活產(chǎn)生多種細胞因子，其中最主要的是Ⅰ型干擾素(IFNα/β)。固有免疫系統(tǒng)中的多種的模式識別受體(PRRs)都與Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生相關(guān)，包括諸如Toll樣受體(TLRs)，RIG-Ⅰ樣受體(RLRs)和內(nèi)源性DNA感受器等。產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素可以進而與其受體結(jié)合，活化J

2、AK(Janus kinase)和STAT(Signaltransducers and activators of transcription)信號通路，進而誘導(dǎo)IFN-stimulated genes(ISGs)的表達，最終清除病毒。
　　骨橋蛋白(osteopontin，OPN)又稱為早期T淋巴細胞活化因子1(early T lymphocyteactivation1,Eta1)，是一種分泌性的多功能糖蛋白。OPN可以調(diào)節(jié)多種

3、生物體進程，包括細胞分化、粘附、骨重構(gòu)、惡性腫瘤和免疫反應(yīng)。長期以來，OPN被認為是一個與炎癥過程有關(guān)的潛在的促炎癥細胞因子，具有促進巨噬細胞分泌IFN-γ和IL-12的作用。近年來，隨著胞內(nèi)形式OPN(iOPN)的發(fā)現(xiàn)，OPN在不同免疫細胞以及免疫反應(yīng)的不同階段中的不同調(diào)控作用逐漸引起人們的重視。而iOPN在固有免疫系統(tǒng)當中尤其是抗病毒免疫當中的作用還未明確。
　　目的:
　　探討OPN，尤其是iOPN是否可以調(diào)節(jié)病毒誘導(dǎo)

4、的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。如若可以調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，闡述其潛在機制。
　　方法:
　　1.首先檢測不同病毒及刺激劑對OPN表達的影響。再利用OPN缺陷型(Spp1-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠的腹腔巨噬細胞，經(jīng)病毒刺激后，檢測IFNβ以及下游多種代表性ISGs的mRNA水平變化、蛋白分泌水平變化等。通過構(gòu)建全長型OPN(full length OPN)及胞內(nèi)形式OPN(iOPN)表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進HEK293細胞，利用雙熒光素酶報

5、告基因，檢測兩種不同形式OPN對于調(diào)節(jié)RNA病毒SeV所活化的IFN表達的影響，并檢測iOPN質(zhì)粒對于各種接頭分子所活化的IFN啟動子區(qū)活性的調(diào)節(jié)作用。
　　2.利用OPN缺陷型(Sppl-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠，通過腹腔注射VSV病毒，檢測VSV病毒在小鼠臟器中的滴度與含量，反應(yīng)兩類小鼠對于VSV病毒的抵抗能力的區(qū)別。
　　3.通過利用OPN缺陷型(Spp1-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠腹腔巨噬細胞，以及iOPN

6、過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，檢測經(jīng)SeV刺激后，重要的IFN轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活化水平變化。
　　4.經(jīng)實時熒光定量PCR(q-PCR)以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，檢測iOPN質(zhì)粒的靶點分子，并經(jīng)免疫共沉淀(co-IP)以及免疫熒光等實驗檢測iOPN與靶點分子的結(jié)合情況。
　　5.明確靶點分子后，利用不同類型的泛素分子質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染iOPN及靶點分子進HEK293細胞，檢測其是否發(fā)生泛素化水平的變化，以及靶點分子的穩(wěn)定性是

7、否發(fā)生變化。
　　6.靶點分子若發(fā)生K48位泛素化水平的變化以及其穩(wěn)定性若發(fā)生變化，說明iOPN可能可以調(diào)節(jié)靶點分子的穩(wěn)定性。通過對靶點已知的泛素化酶以及去泛素化酶進行篩選，尋找可能的作用機制，并通過細胞水平以及體外翻譯系統(tǒng)對結(jié)論進行實驗性確認。
　　7.通過利用細胞過表達載體以及慢病毒表達載體構(gòu)建iOPN-WT、iOPN-N、iOPN-C重組過表達載體，通過體外翻譯系統(tǒng)實驗或?qū)PN缺陷型小鼠腹腔巨噬細胞進行iOPN回補實

8、驗，明確iOPN具體發(fā)生功能的區(qū)域。
　　結(jié)果:
　　1.首先，在利用RNA病毒VSV（水泡性口炎病毒）、SeV（仙臺病毒）以及DNA病毒HSV（單純皰疹病毒）等病毒刺激野生型小鼠腹腔巨噬細胞不同時間點后，發(fā)現(xiàn)OPN的表達都有逐漸升高的趨勢;其次，在OPN缺陷型小鼠以及野生型小鼠巨噬細胞中加入SeV或VSV刺激不同時間后，發(fā)現(xiàn)相比較于野生型組，OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生IFNβ的能力都明顯降低;將構(gòu)建成功的全長型OPN

9、表達載體與iOPN表達載體分別轉(zhuǎn)染進HEK293后經(jīng)SeV刺激后，發(fā)現(xiàn)二種質(zhì)粒都可以使IFNβ表達增強，但是iOPN表達載體組明顯強于全長型OPN表達載體組，并且利用OPN封閉抗體封閉分泌型OPN后，IFNβ的產(chǎn)生無明顯變化，說明全長型OPN所表達的分泌性O(shè)PN可能并不參與調(diào)節(jié)IFNβ的增強過程;iOPN也可以明顯增強RIG-Ⅰ、MDA5、TRIF以及STING&cGAS等接頭分子所介導(dǎo)的IFNβ啟動子區(qū)的活化。
　　2.OPN缺

10、陷型小鼠相比較于野生型小鼠，會產(chǎn)生較少的IFNβ，進而造成此組巨噬細胞或成年小鼠在經(jīng)VSV病毒感染后，VSV病毒的滴度以及VSV mRNA水平以及VSV病毒的蛋白表達程度更高。并且OPN缺陷型小鼠組在大劑量VSV病毒感染后，生存率明顯低于野生型小鼠組。
　　3.前述實驗結(jié)果證明OPN，尤其是iOPN的確可以正調(diào)IFNβ的產(chǎn)生，又由于IRF3是重要的調(diào)控IFNβ表達的轉(zhuǎn)錄因子，我們進而研究IRF3的活化水平是否有變化。我們發(fā)現(xiàn)無論是

11、在啟動子區(qū)結(jié)合、磷酸化、二聚化以及入核等方面，iOPN都可以起到正調(diào)作用，說明iOPN的確是通過影響IRF3轉(zhuǎn)錄因子的活化進而增強了IFNβ的表達。
　　4.為了明確iOPN作用的靶點，我們經(jīng)報告基因以及realtime-PCR等技術(shù)發(fā)現(xiàn)iOPN作用的靶點可能存在于MAVS以及TBK1附近。通過免疫共沉淀我們發(fā)現(xiàn)iOPN可以特異性與TRAF3結(jié)合，并且這一結(jié)論也經(jīng)免疫熒光以及體外蛋白結(jié)合實驗驗證。
　　5.在知道作用靶點為T

12、RAF3后，我們進一步研究可能的機制。泛素化調(diào)節(jié)作用在機體中具有舉足輕重的作用，我們首先研究下iOPN是否會影響TRAF3的泛素化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iOPN可以抑制TRAF3發(fā)生K48位泛素化修飾，即iOPN可以起到穩(wěn)定TRAF3表達的作用。無論是在HEK293細胞中過表達iOPN，或是在OPN缺陷型的小鼠腹腔巨噬細胞，iOPN的過表達或缺失都會導(dǎo)致放線菌酮(CHX)介導(dǎo)的TRAF3的穩(wěn)定性發(fā)生明顯變化。
　　6.由于我們發(fā)現(xiàn)iOPN可

13、以抑制TRAF3發(fā)生K48位泛素化修飾，但由于iOPN本身并沒有去泛素化酶功能，這就提示我們可能iOPN可以抑制某種可介導(dǎo)TRAF3的K48位泛素化作用的E3連接酶與其結(jié)合，或者募集某種可以去除TRAF3的K48位泛素化鏈的去泛素化酶與TRAF3結(jié)合，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)之前有報道過的TRAF3的去泛素化酶USP25并沒有因為iOPN的加入而更加明顯的除去TRAF3上的泛素化鏈，而Triad3A對于TRAF3的K48位泛素化修飾作用則由于iOP

14、N的加入而明顯受到抑制。進而我們發(fā)現(xiàn)iOPN可以明顯的抑制TRAF3與Triad3A的結(jié)合，并且TRAF3的Y440、Q442位點如若被突變則TRAF3不與Triad3A結(jié)合，同時也不與iOPN結(jié)合。綜上說明iOPN可能是通過結(jié)合了TRAF3進而抑制了Triad3A與TRAF3的結(jié)合，iOPN與Triad3A肯能是競爭結(jié)合關(guān)系。
　　7.通過構(gòu)建的iOPN-WT以及iOPN-N端或iOPN-C端截短體，我們發(fā)現(xiàn)iOPN的C端可以與

15、TRAF3發(fā)生結(jié)合，并且通過在OPN缺陷型小鼠腹腔巨噬細胞中進行iOPN回補實驗，我們進一步確定iOPN的C端即足以發(fā)揮結(jié)合TRAF3、抑制TRAF3的K48位泛素化以及增強IFNβ產(chǎn)生的作用。
　　結(jié)論:
　　1.OPN的表達可被病毒所誘導(dǎo)，并且OPN尤其是iOPN可以正調(diào)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。
　　2.OPN在體內(nèi)也是Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的強力正調(diào)者，可以誘導(dǎo)很強的抗病毒免疫應(yīng)答。
　　3.iOPN可以正調(diào)IRF3轉(zhuǎn)錄

16、因子的活化。
　　4.iOPN可以與重要接頭分子TRAF3特異性結(jié)合。
　　5.IOPN可以調(diào)節(jié)TRAF3的K48位偶聯(lián)的泛素化修飾并且使TRAF3更穩(wěn)定。
　　6.iOPN與Triad3A競爭性結(jié)合TRAF3,進而影響Triad3A介導(dǎo)的，TRAF3的K48位偶聯(lián)的泛素化。
　　7.iOPN通過C端與TRAF3結(jié)合，并且其C端即可影響TRAF3的泛素化即穩(wěn)定性。
　　創(chuàng)新點及意義:
　　1.本研究首

17、次明確完善地證明iOPN可以參與調(diào)控抗病毒天然免疫反應(yīng)，可以正向調(diào)節(jié)IFNβ的產(chǎn)生以及具有明顯的抗病毒功能。這一功能的機制是由于iOPN通過抑制Triad3A與TRAF3的結(jié)合，從而抑制了Triad3A對TRAF3的K48位泛素化修飾作用，進而導(dǎo)致TRAF3的穩(wěn)定性增強，IFNβ的活化進而增強。
　　2.本研究提出iOPN可以抑制某分子的泛素化作用這一機制在國際上尚屬少見，極大豐富了我們對于OPN功能的理解。并且我們首次發(fā)現(xiàn)iOP