土壤反硝化微生物對(duì)多環(huán)芳烴污染響應(yīng)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）是一種由2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀組成的烴類化合物，因其具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變作用，對(duì)環(huán)境和人類健康造成較大危害。微生物去除PAHs具有快速、低價(jià)、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是土壤PAHs去除的主要途徑。硝酸鹽具有較高的氧化還原電勢(shì)，即可以為土壤微生物生長(zhǎng)提供所必須的氮源，又可以作為土壤反硝化微生物的電子受體。土壤中的反硝化微生物在70多個(gè)屬

2、中均有分布，且早有研究表明，土壤中PAHs的降解可以與反硝化細(xì)菌所驅(qū)動(dòng)的反硝化過(guò)程相偶聯(lián)，但目前土壤反硝化微生物對(duì)PAHs污染的響應(yīng)機(jī)制還少有報(bào)道。因此，本研究以具有50多年歷史的江漢油田區(qū)域土壤為研究對(duì)象，從該油田的油井口附近采集9個(gè)土壤樣品，編號(hào)為JH-1至JH-9，測(cè)定各土壤樣品的基本理化性質(zhì)及PAHs含量的同時(shí)，以反硝化功能基因narG（硝酸鹽還原酶基因）、nirK（Cu-亞硝酸還原酶基因）和nirS（細(xì)胞色素cd1-亞硝酸還原

3、酶基因）為分子標(biāo)識(shí)，通過(guò)熒光定量-PCR和限制性末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）的方法來(lái)檢測(cè)各樣品中反硝化相關(guān)功能基因的豐度及群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而探討土壤反硝化微生物對(duì)土壤環(huán)境因子及PAHs含量的響應(yīng)機(jī)制。隨后，通過(guò)厭氧微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究反硝化細(xì)菌活性與豐度對(duì)典型PAHs（芘）污染的響應(yīng)，并通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序的方

4、法研究添加硝酸鹽和芘對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。全面探討土壤反硝化細(xì)菌對(duì)PAHs污染的響應(yīng)機(jī)理，以期為進(jìn)一步深入探究PAHs污染與土壤反硝化過(guò)程的相互關(guān)系打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1）江漢油田區(qū)直接采集的農(nóng)田土壤樣品的調(diào)查結(jié)果表明，土壤PAHs含量在0.21~8.10 mg·kg-1之間，污染程度較低。定量-PCR的結(jié)果表明，PAHs含量最高的土壤樣品（JH-4）中反硝化功能基因narG的豐度也最高，相關(guān)性分析表明，該油田區(qū)

5、土壤中narG型微生物豐度與土壤PAHs含量成正相關(guān)關(guān)系（R2=0.58, P＜0.05）；與此相反，PAHs含量最高的土壤樣品（JH-4）中反硝化功能基因nirK和nirS的豐度均最低，相關(guān)性分析表明，土壤nirK及nirS基因的豐度均與土壤PAHs含量呈顯著負(fù)相關(guān)（nirK:R2=0.54, P＜0.05;nirS:R2=0.58, P＜0.05）。克隆文庫(kù)及T-RFLP的結(jié)果則表明，該油田土壤中nirK基因的群落組成在不同樣品間的

6、變異較大，且PAHs含量最高的JH-4中該基因的群落組成與其它各樣品有明顯的不同，冗余分析（redundancy analysis, RDA）的結(jié)果進(jìn)一步表明除有效氮、有效磷外，土壤PAHs含量也是影響nirK型反硝化微生物群落組成的重要因子。相較于nirK，該油田區(qū)土壤中nirS基因的群落組成在不同樣品間的差異較小，但發(fā)現(xiàn)nirS型假單胞菌的豐度與土壤PAHs含量呈正相關(guān)，表明具備較強(qiáng)有機(jī)污染物降解能力的假單胞菌屬可能在該區(qū)域土壤PA

7、Hs的反硝化代謝中起到重要作用。
　　2）在研究?jī)?nèi)容1的基礎(chǔ)上，選擇一個(gè)相對(duì)干凈的土壤樣品（JH-9）作為研究對(duì)象，通過(guò)添加硝酸鹽和芘（典型的4環(huán)PAHs，常被作為檢測(cè)PAHs污染的指示物和其它PAHs生物降解的模型分子）的微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究土壤反硝化細(xì)菌的豐度和活性對(duì)PAHs污染的響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置添加30 mg·kg-1硝酸鹽（N30）和不加硝酸鹽（N0）兩個(gè)處理，每個(gè)處理包含3個(gè)不同的芘濃度（0，30，60 mg·kg

8、-1，分別用P0，P30，P60表示），共6個(gè)處理，分別用N0P0，N0P30，N0P60，N30P0，N30P30和N30P60表示，在厭氧條件下培養(yǎng)45天，并在培養(yǎng)第3，14，28，45天取樣測(cè)量土壤的PAHs含量，N2O，CO2產(chǎn)生速率和相關(guān)反硝化功能基因豐度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)后期（45天），土壤中芘的總降解率在26.14％~43.03%之間，且芘的初始濃度越高，其降解率也越高，但在厭氧培養(yǎng)過(guò)程中硝酸鹽的添加對(duì)芘的降解無(wú)顯著影響

9、。此外，對(duì)土壤N2O產(chǎn)生速率的研究表明，各樣品只在培養(yǎng)初期（3天）檢測(cè)到N2O的釋放，其含量在122.82~379.22μg·kg-1·h-1之間，且硝酸鹽的添加對(duì)土壤N2O的產(chǎn)生速率有顯著的促進(jìn)作用。對(duì)微生物活性的測(cè)定表明，在培養(yǎng)第3，7和14天的CO2產(chǎn)生速率在各處理土壤間無(wú)顯著差別，但在培養(yǎng)后期（45天），添加硝酸鹽的處理中CO2的產(chǎn)生速率顯著高于未添加硝酸鹽的處理。此外，定量PCR的結(jié)果表明，在培養(yǎng)過(guò)程中，反硝化相關(guān)基因的豐度呈

10、現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，但硝酸鹽和芘的添加對(duì)反硝化功能基因的豐度無(wú)顯著影響。
　　3）為了進(jìn)一步研究厭氧條件下添加硝酸鹽和芘對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，在研究2的基礎(chǔ)上，選擇微宇宙培養(yǎng)45天的4個(gè)代表性土壤處理（(N0P0、N0P60、N30P0、N30P60），通過(guò)Illumina miseq測(cè)序技術(shù)解析土壤樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，添加硝酸鹽和芘的處理中土壤的多樣性指數(shù)（Chao1，shannon）均略高于未添加硝酸鹽和芘的處理

11、N0P0。在門水平上對(duì)微生物群落組成分析發(fā)現(xiàn)，Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）和Proteobacteria（變形菌門）細(xì)菌為本研究土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，未添加硝酸鹽的處理（N0P0、N0P60）有相似的細(xì)菌群落組成，但與添加硝酸鹽的處理各細(xì)菌門在豐度存在明顯不同。與不添加硝酸鹽的處理相比，添加硝酸鹽使放線