炎癥因素對(duì)角膜上皮干細(xì)胞活性及衰老的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究慢性炎癥因素對(duì)角膜上皮干細(xì)胞活性及衰老的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立角膜上皮干細(xì)胞模型：采用含BPE和EGF的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2)；在所有試驗(yàn)開始前，均換用僅含EGF不含BPE的KSFM培養(yǎng)基處理1天；用10 ng/ml IL-1β或TNF-α連續(xù)處理角膜上皮干細(xì)胞8天；進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：
　　（1）炎性分子對(duì)細(xì)胞增殖/分化的影響:免疫熒光染色檢測(cè)不同

2、炎癥因子處理的各組細(xì)胞Ki67、importin13、CK3/12、involucrin熒光強(qiáng)度的變化。收集樣本，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞importin13、Bmi1表達(dá)。
　　（2）炎性分子對(duì)角膜上皮干細(xì)胞衰老的影響：免疫熒光染色及Western blot法檢測(cè)不同炎癥因子處理的各組細(xì)胞p16表達(dá)的變化,熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　?。?）炎性分子對(duì)STAT3信號(hào)通路影響：免疫熒光染色及

3、Western blot法檢測(cè)不同炎癥因子處理的各組細(xì)胞p-STAT3表達(dá)的變化。
　　2.建立正常c57BL/6小鼠及p16ink4a缺失小鼠角膜上皮刮除模型，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：
　?。?）小鼠角膜上皮損傷修復(fù)情況的觀察：小鼠角膜上皮刮除術(shù)后24、48、72小時(shí)行熒光素鈉染色，裂隙燈照相，Image J軟件統(tǒng)計(jì)角膜上皮的缺損面積。
　　（2）p16ink4a缺失對(duì)角膜上皮細(xì)胞增殖、干細(xì)胞干性的影響：小鼠角膜上皮刮除術(shù)后4

4、8h，處死取眼球，制作8μm冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光染色檢測(cè)ki67、ABCG2的表達(dá)變化。分別收集正常c57BL/6小鼠及p16ink4a缺失小鼠角膜上皮，Western blot法檢測(cè)Bmi1的表達(dá)，real time PCR檢測(cè)p63、ABCG2的表達(dá)變化。
　?。?）p16ink4a缺失對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響：小鼠角膜上皮刮除術(shù)后48h，分別采用免疫熒光染色和Western blot法檢測(cè)正常c57BL/6小鼠及p16i

5、nk4a缺失小鼠角膜上皮p-STAT3表達(dá)的變化。
　?。?）p16ink4a缺失對(duì)角膜上皮細(xì)胞抗氧化因子表達(dá)的影響：小鼠角膜上皮刮除術(shù)后48h，Western blot法檢測(cè)正常c57BL/6小鼠及p16ink4a缺失小鼠角膜上皮SOD2表達(dá)的變化，PCR檢測(cè)相關(guān)抗氧化基因表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1．IL-β和TNF-α處理可以抑制TKE2細(xì)胞的增殖、干性并促進(jìn)其分化。炎性分子處理TKE2細(xì)胞后，與正常對(duì)照組相

6、比，細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67表達(dá)明顯下降，干細(xì)胞標(biāo)記importin13、Bmi1表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而角膜上皮分化標(biāo)記CK3/12、involucrin的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2．IL-β和TNF-α處理可以誘導(dǎo)TKE2細(xì)胞衰老。炎性分子處理TKE2細(xì)胞后，與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞衰老的典型標(biāo)記p16的表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且伴隨著活性氧ROS的大量聚集。
　　3. IL-β和

7、TNF-α處理可以抑制STAT3活化。炎性分子處理TKE2細(xì)胞后，與正常對(duì)照組相比，角膜上皮細(xì)胞STAT3的活化狀態(tài)p-STAT3的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4. p16ink4a缺失促進(jìn)角膜上皮損傷修復(fù)。p16ink4a缺失小鼠角膜上皮刮除后，上皮再生能力更強(qiáng)，與正常c57BL/6小鼠相比可以顯著促進(jìn)小鼠角膜上皮的愈合速度。
　　5. p16ink4a缺失促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞活性。p1

8、6ink4a缺失小鼠角膜上皮在損傷修復(fù)過程中細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki67表達(dá)更強(qiáng)，干細(xì)胞標(biāo)記ABCG2、Bmi1、p63的表達(dá)更強(qiáng)。
　　6. p16ink4a缺失能夠活化角膜上皮細(xì)胞STAT3信號(hào)通路。角膜上皮刮除術(shù)后48h， p16ink4a小鼠角膜上皮細(xì)胞中p-STAT3熒光強(qiáng)度均明顯強(qiáng)于正常c57BL/6小鼠；Western blot檢測(cè)p16ink4a小鼠角膜上皮細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

9、）。
　　7. p16ink4a缺失促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞抗氧化因子的表達(dá)。角膜上皮刮除術(shù)后48h，p16ink4a小鼠角膜上皮細(xì)胞中SOD2的表達(dá)顯著增強(qiáng)，且抗氧化基因SOD2、Catalase、Hmox1、GCLC、TXN的表達(dá)均明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：炎性因子IL-1β、TNFα等持續(xù)存在下，角膜緣干細(xì)胞的活性喪失，出現(xiàn)衰老特征，p16的表達(dá)顯著增加，并顯著抑制STAT3的活化。而p16ink4a缺失能夠促進(jìn)角膜上皮的損傷修復(fù)