金針菇病毒dsRNA快速檢測(cè)和脫毒方法的研究.pdf

1、金針菇(Flammunlina velutipes)是一種栽培范圍廣、栽培量大的食用菌。病害防控是金針菇栽培生產(chǎn)過程中重要的技術(shù)難點(diǎn)，病毒病是眾多病害的一種，具有潛伏期長(zhǎng)、病癥不穩(wěn)定和不明顯等特點(diǎn)，一旦發(fā)生將造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)金針菇病毒快速檢測(cè)，對(duì)帶病毒菌株進(jìn)行脫毒處理，為研究和生產(chǎn)提供無病毒優(yōu)質(zhì)菌種，對(duì)優(yōu)化市場(chǎng)種質(zhì)資源、育種選材、栽培生產(chǎn)等具有重要意義。
　　本研究以39個(gè)金針菇品種為研究對(duì)象，其中21個(gè)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上主栽

2、品種，利用dsRNA技術(shù)、透射電鏡、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)等分子生物學(xué)和病毒學(xué)技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。比較試劑盒和Redzol這兩種dsRNA檢測(cè)方法，以及研究不同處理對(duì)dsRNA提取的影響，從而建立病毒快速檢測(cè)方法和體系。采用菌絲尖端分離、組織分離（原基、小菇體、菌褶）、原生質(zhì)體再生、原生質(zhì)體單核化、有性生殖和核遷移法共6種對(duì)帶毒菌株進(jìn)行脫毒研究，對(duì)不同脫毒處理菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、生物量、單瓶產(chǎn)量等生物學(xué)和栽培性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)

3、果顯示如下:
　　1.39個(gè)金針菇品種中只在市場(chǎng)主栽品種F-4889、F-4891中提取到dsRNA，大小約2.0kb，透射電鏡觀察到病毒粒子直徑大小約25nm，與已報(bào)道FvBV相似，NCBI序列比對(duì)部分基因組與FvBV相似性均達(dá)99％，證明該病毒為FvBV。
　　2.比較兩種dsRNA提取方法，發(fā)現(xiàn)Redzol法是一種成本低、速度快、易操作的dsRNA檢測(cè)方法，尤其其檢測(cè)成本是試劑盒法的1/10倍，適于普通實(shí)驗(yàn)室和食用菌生

4、產(chǎn)企業(yè)使用;優(yōu)化dsRNA提取方法—Redzol法，從而建立病毒快速檢測(cè)體系。
　　3.對(duì)6種脫毒方法的脫毒效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明:組織分離法、原生質(zhì)體再生法均未能獲得脫毒菌株，而菌絲尖端分離、原生質(zhì)體單核化、有性生殖和核遷移法均可得到脫毒菌株，脫毒率分別為25.0％、7.5％、57.5％、100％;以上脫毒菌株的獲得推測(cè)FvBV存在細(xì)胞質(zhì)中，而非細(xì)胞核內(nèi);攜帶FvBV菌株可將病毒垂直傳播給擔(dān)孢子;在雜交過程中，攜帶FvBV菌株細(xì)

5、胞內(nèi)的病毒未能隨著寄主細(xì)胞核的遷移水平傳播給無毒菌絲。
　　4.不同脫毒處理菌株菌絲生長(zhǎng)速度、生物量、漆酶活力等測(cè)定結(jié)果表明:TIPS、PMH、NM脫毒菌株與原菌株、未脫毒菌株相比均有所增加，PMH、NM脫毒菌株達(dá)到顯著差異水平，但TIPS未達(dá)到顯著水平;栽培實(shí)驗(yàn)表明:TIPS、PMH、NM脫毒菌株發(fā)菌時(shí)間、形成原基時(shí)間和子實(shí)體發(fā)育期均短于帶毒菌株，且單瓶產(chǎn)量、菌柄直徑大于帶毒菌株，也達(dá)到顯著性差異，而脫毒菌株之間無顯著差異，推測(cè)