利用RNAi技術(shù)研究水稻花發(fā)育關(guān)鍵基因PSD1的功能.pdf

1、花器官的誘導(dǎo)形成和分化是高等植物的發(fā)育過(guò)程中特別重要的過(guò)程。近年來(lái)，隨著對(duì)雙子葉植物花發(fā)育機(jī)制研究的深入，尤其是對(duì)模式植物擬南芥和金魚(yú)草的研究，已經(jīng)從最初的“ABC模型”逐步發(fā)展到了相對(duì)完善的“A-E模型”。雙子葉植物花的誘導(dǎo)、形成以及花器官分化的分子遺傳學(xué)機(jī)制已創(chuàng)立。但是，對(duì)單子葉植物花發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)制研究還不深入。因此對(duì)單子葉植物水稻的花器官發(fā)育的研究、對(duì)植物發(fā)育生物學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展有著重要的意義。 本研究的材料水稻突

2、變體psd1(pastel．stamen degeneration)植株，是從臺(tái)灣粳/圭630雜交株F1代花藥培養(yǎng)后代的DH群體中發(fā)現(xiàn)的。psd/植株在抽穗前與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，與正常植株同步進(jìn)入生殖發(fā)育，但其穎花外形明顯膨大，雌雄蕊完全退化，內(nèi)外稃大量增生，形成多重穎殼結(jié)構(gòu)。由此推測(cè)，PSD1基因?yàn)榭刂苹ㄆ鞴侔l(fā)育的關(guān)鍵基因之一，可能在花器官原基分化的早期表達(dá)。本課題組已經(jīng)對(duì)該基因進(jìn)行了精細(xì)定位，并確定了候選基因。 本研究擬用

3、RNAi技術(shù)來(lái)研究該基因的功能，共獲得兩個(gè)方面的結(jié)果。一：構(gòu)建了雙元表達(dá)載體pTCK303-ARⅠ-SRⅠ和pTCK303-ARⅡ-SRⅡ。首先提取了正常PSD1植株在花發(fā)育不同時(shí)期的總RNA,利用設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物P1和P2，以提取的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR后獲得eDNA序列。針對(duì)該cDNA的特異序列設(shè)計(jì)出兩對(duì)引物P3與P4和P5與P6，并用該cDNA為模板進(jìn)行PCR．?dāng)U增獲得片段RI1和R12。將這兩個(gè)片斷連接到pMD18-T v

4、ector上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，PCR檢測(cè)后送。TaKaRa和上海生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示這兩個(gè)片斷大小分別為267bp和337bp；與cDNA中相應(yīng)的片斷比較序列完全相符。分別將這兩個(gè)片段Spe Ⅰ/Sac Ⅰ雙酶切后與同樣經(jīng)過(guò)這兩種酶雙酶切的pTCK303載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞上，篩選后挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒進(jìn)行Spe Ⅰ/Sac Ⅰ雙酶切，電泳后都出現(xiàn)兩條帶，其一是14.6kb的載體

5、片斷，另一條是267bp或337bp的目的片斷。將這兩個(gè)載體分別命名為pTCK303-ARI和pTCK303-ARⅡ。對(duì)上述兩個(gè)載體進(jìn)行。BamHⅠ/Kpn Ⅰ 雙酶切后與經(jīng)過(guò)同樣酶進(jìn)行雙酶切的pTCK303連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，BamH Ⅰ/Sac Ⅰ雙酶切后電泳結(jié)果都顯示兩條帶，一條是14.1左右的載體片斷(不含內(nèi)含子部分)，另一條是長(zhǎng)約1kb(包括正反向目的片斷和內(nèi)含子)的片斷

6、，表明目的片斷已經(jīng)以正向和反向連接到載體中。將該載體分別命名為pTCK303-ARI-SR1和pTCK303-ARⅡ-SRⅡ，提取這兩個(gè)載體的質(zhì)粒用冰凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，用引物P3與P4或者P5與P6進(jìn)行PCR檢測(cè)，能得到目的片斷R11或R12。這表明載體pTCK303-ARI-SRⅠ和pTCK303-AR Ⅱ-SR Ⅱ已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細(xì)胞中去。二：用攜帶載體pTCK303-ARI-SR1和pTCK303