濾膜富集-光鏡檢驗硅藻技術的建立及其法醫(yī)學應用.pdf

1、目的:溺死(drowning)是由于液體機械性地阻塞呼吸道及肺泡，阻礙氣體交換，使機體缺氧，二氧化碳潴留，導致其窒息死亡。我國沿海、沿江地區(qū)溺死的案件相對較多，水中尸體檢驗是法醫(yī)工作中的重要內容。實際檢案中，水中尸體死因多為溺死，但存在拋尸入水偽裝成溺死的可能，因此水中尸體可能與刑事案件相關，必須進行法醫(yī)學鑒定。溺水尸體可呈現出特有的病理征象，如口、鼻部蕈樣泡沫，水性肺氣腫，支氣管內異物等。然而對于一些溺死病理不典型的尸體或是高度腐敗的

2、尸體，由于各種病理征象已不復存在，常需借助其它檢驗技術輔助鑒定溺死。溺死的輔助診斷方法有很多，但其或缺乏特異性，或受尸體腐敗等因素的影響，或者理論、技術不成熟等，使這些方法難以應用于法醫(yī)溺死診斷。溺水過程中，機體劇烈呼吸使溺液中的硅藻通過肺泡毛細血管屏障進入血管，隨血液循環(huán)進入全身各個臟器，加之硅藻分布廣泛和良好的抗酸性和耐腐蝕性使的硅藻檢驗對輔助鑒定溺死具有較強的優(yōu)勢。
　　目前，硅藻檢驗被認為是水中尸體尤其是腐敗尸體溺死診斷較

3、為可靠的證據。法醫(yī)學硅藻檢驗實踐中，主要由三個過程組成:消解、富集和觀察。法醫(yī)學者研究的硅藻檢驗方法多只針對消解過程進行優(yōu)化，而忽略了將三個過程均進行優(yōu)化，他們在實際應用時存在一些問題，如傳統的強酸消解法消解程序簡單，成本低廉，但存在富集效率較低，靈敏度低的問題;使用掃描電鏡觀察硅藻分辨率高，硅藻觀察清晰，種類鑒定容易，但其成本較高，使其應用范圍受到限制。本課題旨在建立一種硅藻檢出率高、操作簡單、安全，對設備要求不高，檢驗成本低的硅藻檢

4、驗方法，使其在硅藻檢驗過程中獲得良好效果，并為基層法醫(yī)學實驗室提供一種合適的硅藻檢驗方法。
　　方法:方法建立:分別使用醇類、醛類、酸類、苯類、丁香酚、樹脂類等試劑與水系濾膜(聚醚砜(PES)材料）、有機系濾膜（尼龍材料）和核孔濾膜（有機化合物材料）相互反應，探索建立一種基于濾膜富集和光學顯微鏡檢測臟器及水樣內硅藻的新方法，并對該法的操作步驟進行優(yōu)化。
　　動物實驗:10只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射過量麻醉劑處死后提取腎臟待檢

5、;廣州市區(qū)段珠江水樣500ml。實驗樣本隨機分為強酸消解-離心富集-光鏡檢驗法組（A組）、微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯用法組（B組）、微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗法組（C組），每組20份樣本;三組樣本分別采用強酸消解-離心富集-光鏡檢驗法（方法A）、微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯用法（方法B）微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗法（方法C）處理。觀察指標為樣本前處理時間、組織消解程度、硅藻總回收率、各硅藻種類回收率、應用效果。
　　尸體

6、樣本:收集2013年2月至2013年10月廣州市水中尸體56例，其中明確溺死的尸體30例、明確死因為死后拋尸入水的尸體26例，并收集同時段廣州市區(qū)陸地死亡的尸體30例。取上述案例尸體的肺、肝、腎組織和對照水樣并分別采用強酸消解-離心富集-光鏡檢驗法（方法A）、微波消解-濾膜富集-掃描電鏡聯用法（方法B）和微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗法（方法C）進行硅藻檢驗。觀察指標為硅藻檢出情況、樣本前處理時間、觀察效果和結果比對。
　　結果:方

7、法建立:經使用7類試劑與3種濾膜交叉對比研究，結果顯示丁香酚—乙酸混合試劑滴加在水系濾膜上立即使濾膜變透明，可直接在光學顯微鏡下觀察，視野干凈，硅藻觀察清晰。同時，建立了一套新的硅藻檢驗方法:微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗法。
　　動物實驗結果:三種硅藻檢驗方法處理2g兔腎組織所需的時間（不包括硅藻觀察），方法A處理時間最長，方法B其次，方法C處理時間最短(P＜0.05)。方法A消解組織不完全，光鏡下可見較多組織碎塊，部分硅藻被碎塊

8、覆蓋，光鏡下計數和鑒定硅藻種類困難;方法B消解組織完全，無組織殘留，硅藻表面紋理清楚，易于計數和鑒定種類;方法C處理樣品后濾膜透光性好，滿足光鏡檢驗要求，消解組織完全，無組織殘留，光鏡下可見硅藻散在密集分布，可觀察到硅藻表面紋理，光鏡下易于計數和鑒定硅藻種類。三種方法的硅藻總回收率分別是2.6±1.7％、76.9±20.2％和54.2±23.1％。方法B硅藻總回收率最高，方法C其次，方法C最低(P＜0.05)。A、B、C三組硅藻各種類的

9、回收率（均值±標準差）分別是2.95±4.11％、65.54±29.66％和45.31±29.69％。方法A硅藻種類回收率最低，方法C其次，方法B硅藻種類回收率最高(P＜0.05)。
　　尸體樣本結果:方法A對溺死組肺中的硅藻種類為39.8±34.6％，硅藻數量為4936.3±9863個/10g，溺死組肝和腎的硅藻種類和硅藻數量均低于方法B和方法C。方法B對溺死組肺中的硅藻種類為69.6±38.5％，硅藻數量為52743.5±82

10、018.8個/10g，溺死組肝和腎的硅藻種類和硅藻數量最高。方法C對溺死組肺中的硅藻種類為39.8±34.6％，硅藻數量為4936.3±9863個/10g，溺死組肝和腎的硅藻種類和硅藻數量高于方法A。方法A處理肺、肝、腎組織的時間較另兩種方法長，方法B其次，方法C處理肺、肝、腎組織樣本的時間最短(P＜0.05)。方法A對肝、腎的觀察效果較差，硅藻檢出量少;方法B對肺、肝、腎組織最好，視野干凈，不影響硅藻觀察;方法C對肺臟和水樣的觀察效果

11、較方法B差，會有異物顆粒影響觀察。
　　結論:本課題建立了一種基于濾膜富集的光學顯微鏡觀察硅藻新技術。消解液中的硅藻富集至水系濾膜（聚醚砜材料）后，可與丁香酚-乙酸試劑相互作用，使濾膜能直接置于光學顯微鏡下觀察。將溺死尸體、死后入水尸體和陸地死亡尸體的樣本采用微波消解-濾膜富集-光鏡檢驗法進行硅藻檢驗研究，并同時比較了其它兩種常用硅藻檢驗方法。本方法在實際案例檢驗過程中具有靈敏度高、能有效避免污染，且簡單、高效、設備要求不高、易于