顳下頜關(guān)節(jié)紊亂“綜合征”三叉神經(jīng)本體覺中樞機(jī)制的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorder, TMD）曾被稱為顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征（TMJDS），即 Costen綜合征，是口頜面部常見的疾患，與咬合的關(guān)系非常密切，臨床上常見的癥狀為顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint, TMJ）彈響、咀嚼肌疼痛，嚴(yán)重的時(shí)候也會(huì)表現(xiàn)出張閉口運(yùn)動(dòng)障礙、耳塞、耳鳴、耳痛、眩暈、咽喉及舌的燒灼感等癥狀。
　　牙周本體覺是一種非常重要的咬合感覺，可以感受

2、食物的厚度、硬度和外部刺激對(duì)牙齒壓力的方向以及大小。牙周的本體覺初級(jí)神經(jīng)元位于三叉神經(jīng)中腦核（trigeminal mesencephalic nucleus, Vme），是唯一的位于中樞的初級(jí)傳入神經(jīng)元，主要由較大的假單極神經(jīng)元組成，生成 I型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（vesicular glutamate transporter1, VGLUT1）。VGLUTs根據(jù)它們不同的特點(diǎn)，被分為三種亞型，定義為VGLUTl、VGLUT2和VGLU

3、T3.在這三種轉(zhuǎn)運(yùn)體中，VGLUTl和VGLUT2的分布比較廣泛，分布在重要神經(jīng)區(qū)域的谷氨酸能神經(jīng)元的神經(jīng)終末。目前 VGLUTl和VGLUT2已經(jīng)被視為谷氨酸能軸突終末的特異性標(biāo)識(shí)物。異常咬合是否可以通過促進(jìn)Vme神經(jīng)元表達(dá)VGLUT1，產(chǎn)生興奮性信號(hào)沖動(dòng)，導(dǎo)致咀嚼肌的異常收縮尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　Vme的中樞突可以投射到一些位于腦干的運(yùn)動(dòng)核團(tuán)，其中不僅包括與三叉系功能密切的三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核（trigeminal motor nu

4、cleus, Vmo），而且包括面神經(jīng)核（支配面肌、莖突舌骨肌、鐙骨肌、二腹肌后腹等）、舌下神經(jīng)核（主要分布到舌肌）等處。異常咬合是否影響這些與Vme的中樞突有突觸聯(lián)系的神經(jīng)元的功能，并表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀，目前還缺乏研究。
　　TMD患者不僅罹患具有明確病理改變的疾病，如骨關(guān)節(jié)炎，而且還伴隨心理（如焦慮、抑郁等）方面的問題。其中，臨床調(diào)查研究證實(shí)焦慮和抑郁等情緒在TMD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用。外側(cè)韁核（lateral ha

5、benula nucleus, LHb）是腦干和邊緣系統(tǒng)相互聯(lián)系的非常關(guān)鍵的腦區(qū)，與焦慮情緒以及抑郁狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)密切。很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)提示負(fù)性條件的刺激可以激活LHb神經(jīng)元，同時(shí)LHb神經(jīng)元有對(duì)Vme有直接的神經(jīng)投射。同時(shí)，LHb神經(jīng)元是谷氨酸能神經(jīng)元，特異性表達(dá)VGluT2.目前 TMD和情緒相關(guān)的研究主要集中在臨床調(diào)查以及動(dòng)物學(xué)行為學(xué)檢測(cè)上，異常咬合是否可以導(dǎo)致 LHb介導(dǎo)的焦慮情緒的出現(xiàn)，以及 LHb的激活對(duì) Vme有何影響均未

6、見研究報(bào)道。
　　我們課題組大量的研究已經(jīng)證實(shí)，對(duì) SD小鼠或者大鼠給予單側(cè)前牙反牙合（Unilateral Anterior Crossbite, UAC）的異常不良的咬合刺激，可以誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)典型的下頜髁突軟骨的骨關(guān)節(jié)炎樣退變。本研究基于該動(dòng)物模型，首先采用霍亂毒素B亞單位(cholera toxin b subunit, CTb)跨節(jié)追蹤、原位分子雜交、免疫熒光、實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blot等研究手段，觀察牙

7、周本體覺對(duì)應(yīng)的中腦核中樞突是否有對(duì)三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的直接投射，并通過檢測(cè)UAC大鼠Vme中VGLUT1的 mRNA水平、Vmo中 VGLUT1蛋白表達(dá)水平以及咬肌乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase, AChE）的表達(dá)水平，論證UAC通過影響Vme牙周本體覺信號(hào)而引起Vmo的興奮性改變，最終導(dǎo)致咬肌的異常收縮；其次，采用在 Vme注射生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran, BDA）順行追蹤的方法，

8、以及免疫熒光以及Western blot等技術(shù)，研究在UAC大鼠與Vme的中樞突有突觸聯(lián)系的神經(jīng)核團(tuán)-面神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核、副神經(jīng)核和疑核的VGLUT1表達(dá)變化，以及對(duì)應(yīng)肌的AChE表達(dá)變化，為異常咬合所造成的以咀嚼運(yùn)動(dòng)功能異常為最主要特點(diǎn)之一的“綜合征”樣表現(xiàn)提供神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。最后，利用 BDA順行追蹤、組織形態(tài)學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)、電生理學(xué)、動(dòng)物行為學(xué)及短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, shRNA）注射等方法，觀察

9、UAC是否引起LHb介導(dǎo)的動(dòng)物焦慮樣行為，檢測(cè)LHb興奮是否可通過VGLUT2途徑進(jìn)一步興奮Vme,進(jìn)而加重Vme的興奮相關(guān)癥狀，從而確定LHb在異常咬合引起的焦慮樣情緒和咀嚼運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能紊亂中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1．UAC導(dǎo)致咬肌異常收縮的本體覺中樞機(jī)制
　　牙周本體覺對(duì)應(yīng)的 Vme中樞突終末，主要分布于同側(cè) Vmo背外側(cè)部的閉口肌區(qū)，幾乎全部CTb標(biāo)記的Vme神經(jīng)元的中樞突終末表現(xiàn)為VGLUT1免疫陽性；

10、UAC大鼠Vme內(nèi)VGLUT1 mRNA的高表達(dá)，切牙牙周和Vmo VGLUT1蛋白水平的高表達(dá)，提示UAC導(dǎo)致Vme的興奮性增高；UAC大鼠咬肌中AChE高表達(dá)，提示UAC大鼠存在咬肌的異常收縮活動(dòng)。
　　2．UAC導(dǎo)致口面部多組肌肉異常收縮的本體覺中樞機(jī)制
　　Vme注射BDA，結(jié)果顯示中腦核中樞突可以直接投射到Vmo、面神經(jīng)核和舌下神經(jīng)核等神經(jīng)核團(tuán)所在的運(yùn)動(dòng)核區(qū)；UAC大鼠的面神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核以及副神經(jīng)核VGLUT1

11、蛋白水平的高表達(dá)，鐙骨肌、舌肌、胸鎖乳突肌的AChE表達(dá)量也明顯高于對(duì)照組。UAC大鼠的疑核中VGLUT1也高表達(dá)。本項(xiàng)結(jié)果這提示：UAC大鼠Vme神經(jīng)元興奮性的提高可進(jìn)一步導(dǎo)致腦干多個(gè)運(yùn)動(dòng)核團(tuán)神經(jīng)元的興奮。
　　3．UAC引起外側(cè)韁核興奮和動(dòng)物焦慮行為
　?。?）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字實(shí)驗(yàn)均顯示，UAC刺激后4周開始出現(xiàn)明顯的活動(dòng)減少，并一直持續(xù)到12周觀察期結(jié)束；
　?。?）UAC的LHb神經(jīng)元興奮性明顯增強(qiáng)，具體表現(xiàn)

12、為L(zhǎng)Hb神經(jīng)元中VGLUT2的mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。
　　4．UAC大鼠LHb對(duì)Vme神經(jīng)元的興奮性調(diào)控作用
　?。?）注射BDA于LHb,在Vme平面可見BDA與VGLUT2雙標(biāo)神經(jīng)軸突終末分布于小白蛋白陽性的神經(jīng)元周圍。
　?。?）在LHb區(qū)域注射VGLUT2 shRNA慢病毒，可明顯提高UAC大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中心區(qū)活動(dòng)，以及十字高架實(shí)驗(yàn)中在開臂區(qū)活動(dòng)的次數(shù)和時(shí)間，表明 VGLUT2介導(dǎo)了UAC大鼠LHb神經(jīng)元的

13、興奮性活動(dòng)。
　?。?）UAC大鼠Vme神經(jīng)元區(qū)域VGLUT2的蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，在UAC大鼠LHb區(qū)域注射VGLUT2 shRNA慢病毒，可明顯降低LHb神經(jīng)元VGLUT2的mRNA表達(dá)水平，并降低Vme的VGLUT2蛋白表達(dá)水平；這提示LHb對(duì)Vme有興奮性調(diào)控作用。
　?。?）在LHb注射VGLUT2 shRNA慢病毒后，進(jìn)行Vme神經(jīng)元電生理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)注射了 shRNA的大鼠，其靜息膜電位與動(dòng)作電位發(fā)放閾高于沒有

14、注射 shRNA的 UAC大鼠，而動(dòng)作電位幅度、動(dòng)作電位半-寬時(shí)程以及動(dòng)作電位衰減時(shí)間明顯短于沒有注射shRNA的UAC組，而且后超極化電位幅度高于沒有注射shRNA的UAC組。給予較長(zhǎng)的電流刺激，相對(duì)于UAC組，注射shRNA的UAC大鼠的Vme神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放數(shù)量出現(xiàn)減少，同時(shí)發(fā)放頻率和幅度也明顯降低。這些數(shù)據(jù)說明，針對(duì)LHb的VGLUT2 shRNA可以成功抑制Vme神經(jīng)元的興奮性。
　　研究結(jié)論：
　　1．UAC

15、可以通過興奮牙周本體感受器，增強(qiáng)Vme的活性，進(jìn)而通過直接的突觸聯(lián)系興奮Vmo，導(dǎo)致咬肌收縮異常。
　　2．UAC可以導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)咀嚼肌、鐙骨肌、舌肌、胸鎖乳突肌等口頜面、耳、頸部骨骼肌的異常興奮，還可興奮疑核，并可導(dǎo)致焦慮情緒的出現(xiàn)。因此，三叉神經(jīng)本體覺變化在以顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎為重癥表現(xiàn)的綜合征樣疾病過程中占據(jù)著中心地位。
　　3．UAC可以通過激活LHb,導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)焦慮情緒；LHb激活后，又可以通過直接突觸聯(lián)系，進(jìn)一