日本囊對(duì)蝦stylicin抗菌肽和i型溶菌酶的基因克隆與表達(dá)研究.pdf

1、日本囊對(duì)蝦(Musupenaeus japonicus)是我國沿海重要養(yǎng)殖對(duì)蝦品種，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來日本囊對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模受病害影響停滯不前，尤其是白斑綜合癥病毒(WSSV)等病毒性對(duì)蝦病對(duì)日本囊對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)蝦病毒病的預(yù)防和治療的方法效果均十分有限，而濫用亂用藥物易誘發(fā)水質(zhì)污染和藥物殘留等嚴(yán)重問題。因此，盡快找到環(huán)保高效的治療方法與策略，成為當(dāng)前海水對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迫切需要解決的重要科學(xué)問題。抗菌肽(AM

2、Ps)是對(duì)蝦抵御病原入侵的一類重要的非特異性免疫成分，其抗細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲等特性引起了海洋生物學(xué)者的重視，正在開展進(jìn)一步的研究與探索。
　　本研究以日本囊對(duì)蝦為研究對(duì)象，成功克隆日本囊對(duì)蝦stylicin抗菌肽和i型溶菌酶基因，分析其分子結(jié)構(gòu)特征;檢測(cè)它們的時(shí)空表達(dá)變化，探究其組織分布特異性，對(duì)WSSV侵染的免疫應(yīng)答模式，以及在對(duì)蝦早期不同幼體發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律;初步探索日本囊對(duì)蝦stylicin抗菌肽和i型溶菌酶的原核表

3、達(dá)條件。研究獲得以下結(jié)果:
　　1.日本囊對(duì)蝦stylicin抗菌肽的基因克隆與表達(dá)研究
　　通過分子克隆、重組DNA和RACE等技術(shù)獲得日本囊對(duì)蝦stylicin(命名為Mj-sty)基因的cDNA序列，全長(zhǎng)428bp，其中開放閱讀框315bp，共編碼104個(gè)氨基酸，由具有22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和82個(gè)氨基酸殘基的成熟肽組成。Mj-sty預(yù)測(cè)分子量為8.69kDa，等電點(diǎn)為4.79。Mj-sty基因組DNA長(zhǎng)度為662b

4、p，具有1個(gè)234bp的內(nèi)含子，符合gt-ag剪切特征。同源性分析顯示，Mj-sty氨基酸序列與細(xì)角濱對(duì)蝦的stylicin抗菌肽相似度最高;系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Mj-sty的分子進(jìn)化地位與對(duì)蝦科的傳統(tǒng)分類學(xué)基本一致，且發(fā)現(xiàn)該類抗菌肽具有更廣泛的物種分布。
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究Mj-sty mRNA的時(shí)空表達(dá)。組織分布研究表明，Mj-sty在日本囊對(duì)蝦鰓和血細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較高，具有組織表達(dá)特異性。WSSV誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)

5、果表明，在WSSV病毒侵染初期Mj-sty顯著下降，在12h時(shí)則顯著上升出現(xiàn)峰值，而后又急劇下降，并于72h出現(xiàn)最低值，96h時(shí)逐漸回升接近正常水平。提示M j-sty表達(dá)變化過程與病毒侵染過程相關(guān)，Mj-sty參與了機(jī)體對(duì)病毒W(wǎng)SSV的免疫過程。Mj-sty在對(duì)蝦早期發(fā)育不同階段的表達(dá)譜表明它的表達(dá)在對(duì)蝦發(fā)育過程發(fā)生顯著的變化，發(fā)現(xiàn)在受精卵期Mj-sty mRNA已有微弱表達(dá)，在蚤狀幼體和糠蝦幼體的食性轉(zhuǎn)換期和不同階段變態(tài)期均有顯著的

6、上升，在仔蝦階段呈現(xiàn)出前高后低的情況，此時(shí)對(duì)蝦正由浮游向底棲生活習(xí)性轉(zhuǎn)變。以上說明Mj-sty在對(duì)蝦發(fā)育早期的表達(dá)受到對(duì)蝦變態(tài)活動(dòng)過程、環(huán)境變化、食性及生活習(xí)性轉(zhuǎn)變等因素影響。
　　基于Mj-sty核苷酸序列成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-Mj-sty，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，Mj-sty重組蛋白主要以不可溶的包涵體形式表達(dá)。有待于進(jìn)一步純化和功能活性驗(yàn)證等方面的研究。
　　2.日本囊對(duì)蝦i型溶菌酶的基因克隆與表達(dá)研究<

7、br>　　通過分子克隆、重組DNA和RACE等技術(shù)獲得了日本囊對(duì)蝦i型溶菌酶(命名為Mj-ilys)的cDNA序列，全長(zhǎng)580 bp，其中ORF為429bp，共編碼142個(gè)氨基酸，由具有17個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和125個(gè)氨基酸殘基的成熟肽組成，Mj-ilys預(yù)測(cè)分子量為14.099kDa，等電點(diǎn)為4.18。分析發(fā)現(xiàn)Mj-ilys氨基酸序列中含有10個(gè)半胱氨酸殘基，預(yù)測(cè)可形成5對(duì)二硫鍵以穩(wěn)定分子構(gòu)象。三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，Mj-ilys空間結(jié)構(gòu)保

8、守，與其他無脊椎動(dòng)物的i型溶菌酶立體構(gòu)象相近。Mj-ilys基因組DNA序列長(zhǎng)度為719bp，具有1個(gè)139bp的內(nèi)含子，符合gt-ag剪切特征。同源分析顯示，Mj-ilys氨基酸序列與斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦的i型溶菌酶的相似性分別高達(dá)82％和80％，其發(fā)揮溶菌酶活性和異肽酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸殘基均被替換，將致使Mj-ilys喪失相關(guān)活性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Mj-ilys與斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦的i型溶菌酶的親緣關(guān)系最近。
　　通過

9、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究Mj-ilys mRNA的時(shí)空表達(dá)。組織分布研究顯示，Mj-ilys在日本囊對(duì)蝦肝胰腺中表達(dá)量相對(duì)最高，其他組織均非常低，具有顯著的組織分布特異性。WSSV誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在WSSV病毒侵染初期Mj-ilys顯著下降，6h后略有回升，于12h時(shí)達(dá)到峰值，后又逐漸下降，至72 h時(shí)出現(xiàn)最低值，96h時(shí)有所回升。提示Mj-ilys的表達(dá)變化與病毒侵染過程有關(guān)，Mj-ilys參與對(duì)蝦抗病毒的免疫響應(yīng)過程。Mj-il

10、ys在對(duì)蝦發(fā)育早期不同階段的表達(dá)譜表明它的表達(dá)在對(duì)蝦早期發(fā)育過程中發(fā)生顯著的變化，在受精卵期即胚胎發(fā)育階段即能檢測(cè)到其mRNA，而后在蚤狀幼體Ⅱ、Ⅲ期出現(xiàn)極顯著的上調(diào)表達(dá)，此時(shí)對(duì)蝦開口攝食，細(xì)菌等病原隨食物進(jìn)入體內(nèi)或引發(fā)免疫響應(yīng)表達(dá)，糠蝦幼體各期表達(dá)量均較低，仔蝦期Mj-ilys表達(dá)量先升高后降低，這或與對(duì)蝦由浮游向底棲生活習(xí)性轉(zhuǎn)變有關(guān)。結(jié)果顯示，Mj-ilys參與了對(duì)蝦早期發(fā)育過程中變態(tài)、免疫和習(xí)性改變等過程。
　　根據(jù)已獲得M