類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)聯(lián)基因NLRP1啟動(dòng)子區(qū)rs878329的功能研究.pdf

1、研究背景：RA是一種以關(guān)節(jié)及滑膜組織炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病。雖然RA的病因?qū)W目前并十分清楚，但是現(xiàn)在已達(dá)成共識(shí)：RA是由多個(gè)基因和未知的環(huán)境誘因相互作用的結(jié)果。近期有文獻(xiàn)報(bào)道在高加索人群中，nucleotide-binding,leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1（NLRP1）是白癜風(fēng)以及白癜風(fēng)相關(guān)的自身免疫性疾病的易感基因。此外，至少有兩組獨(dú)立的突變位點(diǎn)：一

2、組位于NLRP1的基因內(nèi)，tagSNP rs6502867；而另一組位于NLRP1的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，tagSNP rs2670660,rs878329, rs7223628, rs8182352, rs4790796, and rs4790797。然而，NLRP1是否也是RA的易感基因目前尚無(wú)定論。我們注意到大約25％～30％的廣泛性白癜風(fēng)病人患有至少一種其他類(lèi)型的自身免疫性疾病，其中包括RA。由此我們提出假設(shè)：在漢族人群中，NRLP1相關(guān)

3、的突變位點(diǎn)可能與RA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。前期的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)rs878329與RA的發(fā)病具有顯著關(guān)聯(lián)性。本文對(duì)rs878329 進(jìn)行了初步的功能研究，借以分析該多態(tài)性位點(diǎn)是否具有功能活性。
　　 研究目的：探討rs878329對(duì)NLRP1轉(zhuǎn)錄的影響以及進(jìn)一步證實(shí)該多態(tài)性位點(diǎn)的生物學(xué)功能。
　　 研究方法：提取健康志愿者外周血細(xì)胞的基因組DNA，通過(guò)TaqMan 探針?lè)ㄟM(jìn)行基因分型，再通過(guò)熒光定量PCR在不同基因型的

4、外周血細(xì)胞樣本中檢測(cè)NLRP1mRNA的表達(dá)，分析不同基因型對(duì)NLRP1轉(zhuǎn)錄的影響；將構(gòu)建好的不同單倍型的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析不同單倍型轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能是否具有差異；通過(guò)EMSA和Supershift 體外分析不同等位的寡核苷酸結(jié)合核蛋白的能力。
　　 研究結(jié)果：（1）不同基因型健康志愿者NLRP1mRNA表達(dá)量存在差異，G/G基因型健康志愿者mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著高于C/C基因型健康志愿者（P

5、＜0.01，G/C基因型健康志愿者mRNA 相對(duì)表達(dá)量介于兩者之間；（2）將不同單倍型的DNA 片段克隆至pGL3-Promoter 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)熒光素酶相對(duì)活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，單倍型G的熒光素酶相對(duì)活性顯著高于單倍型C，但是在含有4個(gè)copies 片段的重組質(zhì)粒中，單倍型G和單倍型C的熒光素酶相對(duì)活性卻沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。將不同單倍型重組質(zhì)粒分別與Runx1真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞后，過(guò)

6、量表達(dá)Runx1能顯著抑制單倍型G的熒光素酶相對(duì)活性，而對(duì)單倍型C 卻沒(méi)有抑制作用；（3）生物學(xué)分析(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)預(yù)測(cè)到G等位所在DNA 序列是轉(zhuǎn)錄因子Runx1的結(jié)合位點(diǎn)。因此，分別合成G和C兩種等位探針進(jìn)行EMSA 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，G等位探針與核蛋白產(chǎn)生一條結(jié)合帶，而C等位探針卻不能。通過(guò)Supershift分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入了抗Runx1抗體后，G等位探針的泳

7、道中出現(xiàn)一條超滯留結(jié)合帶，提示G等位探針能夠與Runx1發(fā)生特異性結(jié)合。
　　 結(jié)論：（1）本研究發(fā)現(xiàn)單倍型G能顯著增強(qiáng)NLRP1轉(zhuǎn)錄活性，使得 G/G基因型健康志愿者NLRP1mRNA表達(dá)的顯著增加。由此推測(cè)單倍型G 可能通過(guò)上調(diào)NLRP1的表達(dá)增加了RA的易感性；（2）G等位所在DNA 序列是轉(zhuǎn)錄因子Runx1的結(jié)合位點(diǎn)，增加其結(jié)合位點(diǎn)或者過(guò)量表達(dá)Runx1，均能顯著降低NLRP1轉(zhuǎn)錄活性，由此推測(cè)Runx1是針對(duì)G等位的一