下一代測(cè)序技術(shù)在混合DNA分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：盡管這些年對(duì)于混合DNA的分型研究取得了一些進(jìn)展，但仍有諸多問(wèn)題未得到有效解決，混合DNA分型依然是當(dāng)前法醫(yī)遺傳學(xué)研究的難點(diǎn)。鑒于傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳 STR分型技術(shù)的局限性，不能充分挖掘混合 DNA中蘊(yùn)藏的遺傳信息。近幾年來(lái),下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）引起了法醫(yī)學(xué)者的極大興趣同時(shí)法醫(yī)學(xué)者也正致力于將其向法醫(yī)遺傳領(lǐng)域應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。下一代測(cè)序 STR分型技術(shù)較毛細(xì)管電泳具有極大的優(yōu)勢(shì)，它

2、既能觀察各 STR基因座的長(zhǎng)度多態(tài)性信息，又能檢測(cè)到各基因座序列多態(tài)性信息，從中發(fā)掘出更多信息，這為混合DNA解釋提供了一個(gè)新的研究方向。因此，本研究擬采用Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel在Ion Torrent PGM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析，分為系列實(shí)驗(yàn)對(duì)其重復(fù)性、一致性、靈敏度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部評(píng)價(jià)，在此基礎(chǔ)上，利用NGS平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的兩男混合DNA樣本進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)混合DNA主要參數(shù)進(jìn)行評(píng)估并采用

3、本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的sepDNA軟件進(jìn)行分析，旨在為混合DNA解釋提供參考。
　　方法：
　　1.樣本采集：取自河北省血液中心50份無(wú)關(guān)健康男性個(gè)體抗凝血樣。3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品分別為9948 male DNA、2800 Control DNA和DNA Control007。
　　2.DNA提?。簯?yīng)用ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System試劑盒提取血樣DNA，采用NanoQ微型分光光度計(jì)進(jìn)行全基因

4、組DNA純度檢測(cè)。
　　3.DNA定量：應(yīng)用Quantifiler Human DNA Quantification Kit定量試劑盒對(duì)提取的全基因組DNA以及3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品采用7500 Real-time PCR System進(jìn)行絕對(duì)定量。
　　4.樣本準(zhǔn)備
　　4.1.實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)部分：
　　以9948 Male DNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，平行實(shí)驗(yàn)3次進(jìn)行重復(fù)性研究；以取自河北省血液中心17份無(wú)關(guān)健康男性個(gè)體抗

5、凝血樣和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序進(jìn)行一致性研究；以9948 Male DNA標(biāo)準(zhǔn)品絕對(duì)定量結(jié)果制備系列起始DNA模板量(1 ng、500 pg、200 pg、100 pg、50 pg)進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本平行實(shí)驗(yàn)2次進(jìn)行靈敏度研究。
　　4.2.混合DNA部分：
　　根據(jù)定量結(jié)果以 DNA濃度非常接近為歸類標(biāo)準(zhǔn)，將50個(gè)男性樣本的DNA定量結(jié)果進(jìn)行歸類分組，選出其中符合標(biāo)準(zhǔn)的單一DNA樣本構(gòu)建4組兩男混合DNA樣本，每組混合樣本設(shè)定4個(gè)

6、混合比率(1:1、1:4、1:9和1:19)。每個(gè)混合樣本平行實(shí)驗(yàn)兩次。
　　5.文庫(kù)構(gòu)建：應(yīng)用 Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel和Precision ID Library Kit按照說(shuō)明構(gòu)建文庫(kù)。除外靈敏度研究中采用制備的起始DNA模板量外，其余樣本均稀釋至1 ng/μl，采用1 ng起始DNA模板量構(gòu)建文庫(kù)。
　　6.模板制備：采用Ion PGM HiQ OT2 Kit在Ion

7、 OneTouch2 System儀器上按照說(shuō)明制備測(cè)序模板。
　　7.Ion PGM測(cè)序：采用Ion PGM HiQ STR Sequencing Kit，在Ion PGM System按照手冊(cè)說(shuō)明進(jìn)行測(cè)序操作。
　　8.測(cè)序數(shù)據(jù)處理：測(cè)序結(jié)果采用 Ion Torrent Suite以及附帶的HID_STR_Genotyper和CoverageAnalysis進(jìn)行分析。
　　9.CE-STR分型：所有單一樣本同時(shí)采用

8、PowerPlex Fusion System進(jìn)行檢測(cè)分型，用于與NGS-STR分型的比較。
　　10.結(jié)果分析：首先對(duì)分析閾值確定等位基因和過(guò)濾 noise的效能進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)對(duì)樣本DoC、基因座平均DoC、基因座序列構(gòu)成比以及ACR等參數(shù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上對(duì)測(cè)序樣本的重復(fù)性、一致性和靈敏度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，綜合評(píng)價(jià)在本實(shí)驗(yàn)室的效能。利用NGS平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的兩男混合DNA樣本進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)混合DNA主要參

9、數(shù)進(jìn)行評(píng)估并采用本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的sepDNA軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)：
　　1.1.分析閾值
　　在默認(rèn)分析閾值（即AT=5％）能過(guò)濾掉絕大多數(shù)noise序列達(dá)到較好的效能。
　　1.2.數(shù)據(jù)質(zhì)量分析
　　數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示，樣本平均DoC為2535×；基因座平均DoC為2542×；在基因座序列構(gòu)

10、成比中，基因座%allele平均為90.83%，%stutter平均為4.22%，%noise平均為5.21%；STR基因座ACR平均為0.76，有2個(gè)基因座（D12S391和D12ATA63）平均ACR<0.6。
　　1.3.重復(fù)性研究
　　3.次重復(fù)間等位基因分型一致并且%Allele和ACR均無(wú)顯著性差異。
　　1.4.一致性研究
　　在CE-STR與NGS-STR可比較的761個(gè)等位基因中有758（99.

11、61%）個(gè)等位基因分型一致，兩者有3（0.39%）個(gè)等位基因在 D18S51出現(xiàn)不一致性分型。同時(shí)在 D2S441、D1S1656、D8S1179、D3S1358、vWA、D21S11、D2S1338和D12S391等8個(gè)基因座檢出同等位基因。
　　1.5.靈敏度研究
　　在默認(rèn)分析閾值下，起始DNA模板量低至100 pg時(shí)等位基因仍可被完全檢出；起始DNA模板量為50 pg時(shí)等位基因發(fā)生較多的dropout，等位基因檢出率

12、為88.68%。不同起始 DNA模板量 ACR顯示，起始 DNA模板量低至100 pg，平均ACR為0.598，仍能得到較好的均衡性。隨著起始模板量的降低，平均 ACR從0.729降至0.329，CV從23.95%增至98.21%。
　　2.Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel對(duì)混合DNA分型的研究：
　　混合DNA研究中8個(gè)單一樣本構(gòu)建4組混合樣本，每組混合樣本設(shè)置4個(gè)不同混合比率，

13、總共含有16個(gè)混合樣本，每個(gè)混合樣本平行實(shí)驗(yàn)2次。計(jì)算每個(gè)樣本平均等位基因檢出個(gè)數(shù)時(shí)按照四舍五入取整數(shù)的方式進(jìn)行等位基因計(jì)數(shù)。
　　2.1.等位基因的序列信息進(jìn)行同等位基因的區(qū)分
　　NGS-STR可以檢測(cè)等位基因的序列差異進(jìn)行同等位基因的區(qū)分。例如，觀察到在混合比率1:9，vWA基因座次要組分（14，17）和主要組分（17，18）共享等位基因17。利用序列差異，次要組分等位基因17能夠從主要組分等位基因中得到區(qū)分；D1S1

14、656基因座次要組分(11,14)的等位基因11與主要組分（12，15）等位基因12的n-1 stutter重疊，利用序列差異可以將兩者進(jìn)行區(qū)分。
　　2.2.各混合比率樣本基因座平均DoC
　　在混合比率為1:1時(shí)，基因座平均DoC最低為451±130×（FGA），最高為7263±2105×（Amelogenin）。在混合比率為1:4時(shí)，基因座平均DoC最低為698±222×（FGA），最高為10636±3520×（TPO

15、X）。在混合比率為1:9時(shí)，基因座平均DoC最低為565±223×（D3S4529），最高為9249±1640×（TPOX）。在混合比率為1:19時(shí)，基因座平均 DoC最低為563±214×（D3S4529），最高為10571±2176×（TPOX）。
　　2.3.不同混合比率等位基因檢出情況
　　在混合比率為1:1、1:4、1:9和1:19時(shí)，默認(rèn)分析閾值下每個(gè)混合比率總的等位基因檢出數(shù)目分別為365、354、309和28

16、1個(gè)，分別有0、0、7和15個(gè)等位基因丟失，等位基因檢出率分別為100%，96.98%、84.66%和76.99%。在混合比率為1:1、1:4、1:9和1:19時(shí)，每個(gè)混合比率的次要組分未共享等位基因分別共檢出134、134、130和121個(gè)，在默認(rèn)分析閾值下分別共檢出134、124、78和49個(gè)，檢出率分別為100%、92.54%、60.00%和40.50%。
　　2.4.混合DNA主要參數(shù)評(píng)估
　　2.4.1.混合DNA

17、雜合型均衡比（Hb）
　　混合樣本主要組分平均 Hb在每個(gè)混合比率展現(xiàn)了較好的均衡性，在4個(gè)混合比率中平均Hb最小值為0.70，最大值為0.78。在混合比率為1:1和1:4時(shí)，次要組分平均Hb分別為0.73和0.67，均呈現(xiàn)出較好的均衡性；在混合比率為1:9和1:19時(shí)，Hb呈現(xiàn)較大變異甚至發(fā)生雜合性丟失，平均Hb分別為0.54和0.45。
　　2.4.2.D值和實(shí)測(cè)混合比例（Mx1）分析
　　Mx分析中基因座D值分布

18、顯示所有基因座絕大部分?jǐn)?shù)據(jù)位于D值＜0.2且基因座DoC＜4000×的區(qū)間內(nèi)，其中82%的基因座D值＜0.1，93%的基因座D值＜0.15。除1:1外，其余混合比率絕對(duì)部分D值均＜0.1?；旌媳嚷蕿?:1時(shí)，4個(gè)樣本Mx1最小值為0.47，最大值為0.49；混合比率為1:4時(shí)，4個(gè)樣本Mx1最小值為0.16，最大值為0.19；混合比率為1:9時(shí)，4個(gè)樣本Mx1最小值為0.08，最大值為0.12；混合比率為1:19時(shí)，4個(gè)樣本 Mx1最小

19、值為0.05，最大值為0.07?；旌媳嚷蕪?:1降低至1:19時(shí)，變異系數(shù)從27.21%增至54.19%。
　　2.5.sepDNA軟件分析—分離準(zhǔn)確率
　　2.5.1.整體分離準(zhǔn)確率
　　在最優(yōu)基因型，Bayes和Iter數(shù)學(xué)模型的分離準(zhǔn)確率分別為64.91%；和64.28%；兩者分離準(zhǔn)確率沒(méi)有顯著性差異（P=0.7734）。在考慮備選基因型后，Bayes和Iter數(shù)學(xué)模型的分離準(zhǔn)確率分別為74.18%和71.13%

20、，兩者分離準(zhǔn)確率沒(méi)有顯著性差異（P=0.1353）。
　　2.5.2.不同混合比率分離準(zhǔn)確率
　　在最優(yōu)基因分型時(shí)，Bayes數(shù)學(xué)模型在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為52.15%、75.76%、72.40%和65.05%；Iter數(shù)學(xué)模型在在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為50.14%、75.36%、72.39%和65.07%。在考慮備選基因型分型后，Bayes數(shù)學(xué)模型在1:1、1:4、

21、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為65.17%、84.87%、81.73%和73.20%；Iter數(shù)學(xué)模型在在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為58.82%、83.74%、79.10%和68.08%。
　　2.5.3.等位基因共享對(duì)分離準(zhǔn)確率的影響
　　Bayes數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，在最優(yōu)基因型時(shí)，有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為60.00%，未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為71.83%，兩者存在顯著性差異（P=0.000

22、2）；在考慮備選基因型后，有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為70.81%，未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為78.93%，兩者存在顯著性差異（P=0.0048），提示在兩種情形下未共享基因座的分離準(zhǔn)確率均顯著高于共享基因座。Iter數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，在最優(yōu)基因型時(shí)，有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為59.64%，未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為70.81%，兩者存在顯著性差異（P=0.0004）；在考慮備選基因型分型后，有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為66.67%，未共享

23、基因座的分離準(zhǔn)確率為77.41%，兩者存在顯著性差異（P=0.0003），提示在兩種情形下未共享基因座的分離準(zhǔn)確率顯著高于共享基因座。
　　結(jié)論：
　　1.Precision ID GlobalFiler NGS STR Panel結(jié)合Ion Torrent PGM平臺(tái)在本實(shí)驗(yàn)室展現(xiàn)了良好的表現(xiàn)可以成功地應(yīng)用于STR分析。
　　2.應(yīng)用NGS技術(shù)進(jìn)行混合DNA的STR分型，較CE-STR分型技術(shù)可獲得更多有價(jià)值的信息如