CCK系統(tǒng)在創(chuàng)傷后應激障礙大鼠條件恐懼記憶中的作用及其機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷后應激障礙（Posttraumatic stress disorder，PTSD）是慢性的精神障礙性疾病，病因是由于遭受應激和創(chuàng)傷經(jīng)歷造成的，如家庭暴力、自然災害或戰(zhàn)爭等相關的創(chuàng)傷。PTSD是以過度恐懼為特征的，并伴隨敏感性增高，從而損害生活質(zhì)量，并且引起多種疾病、社會和職業(yè)問題。目前，人們常把PTSD定義為焦慮障礙性疾病，但大量研究證明PTSD更適合歸為學習和記憶障礙類的疾病，因為它包括恐懼記憶的過度鞏固和消退的受損。恐懼反應的改

2、變可能導致侵入性記憶和倒敘，增強了回避提示線索和自主覺醒癥狀。許多研究證明杏仁核是影響PTSD的關鍵核團。尤其是杏仁核基底外側核(BLA)對于情感記憶的形成非常重要，在條件恐懼的獲得和表達中起重要作用。所以，目前BLA在PTSD的研究中更受關注。
　　在過去的研究中，膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)被認為是與學習記憶、焦慮和恐懼等腦高級活動有密切關系的神經(jīng)肽類物質(zhì)。CCK及其受體在大腦中廣泛分布，如，皮質(zhì)、海馬

3、和杏仁核等。過去的一些研究證實了在BLA內(nèi)的神經(jīng)元存在高濃度的CCK和CCK mRNA。杏仁核內(nèi)的CCK陽性神經(jīng)元對調(diào)節(jié)錐體神經(jīng)元的興奮性和突觸的整合具有很強的作用。以往的研究證明激活BLA內(nèi)的CCK受體可以損傷恐懼記憶的消退。動物模型和人類影像學研究證據(jù)表明PTSD的一個潛在機制就是突觸可塑性的異常。而先前的研究也已表明CCK可以增強海馬的長時程增強并且增強實驗動物的空間記憶能力。所以我們有理由認為CCK系統(tǒng)與PTSD的形成機制密切相

4、關。然而，BLA內(nèi)的CCK系統(tǒng)對PTSD的形成機制的影響尚無深入研究。
　　過去的數(shù)據(jù)表明PTSD需要從病因研究入手，因為恐懼記憶的起始與巴普洛夫條件恐懼有相似的過程。因此我們建立了環(huán)境相關的條件恐懼模型作為PTSD的動物模型。在此模型的基礎上我們進一步探討了BLA內(nèi)CCK系統(tǒng)在PTSD發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制，同時在細胞水平上明確CCK受體在引起PTSD相關癥狀后的相關信號轉(zhuǎn)導機制。以期為臨床治療PTSD選擇有效的靶點提供生物

5、學依據(jù)。
　　第一部分、創(chuàng)傷后應激障礙大鼠杏仁核內(nèi)CCK系統(tǒng)及相關神經(jīng)遞質(zhì)的變化
　　目的:以巴甫洛夫條件模型為基礎建立與PTSD恐懼癥狀相關的動物模型;在此模型的基礎上觀察給予厭惡刺激后內(nèi)源性CCK系統(tǒng)的變化，包括細胞外和細胞內(nèi)CCK水平，以及CCK受體;同時也觀察了給予厭惡刺激后其他相關的神經(jīng)遞質(zhì)的變化，包括兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，HPA軸的相關遞質(zhì)，以及與學習記憶相關的神經(jīng)遞質(zhì)。
　　方法:①建立PTSD

6、的動物模型，通過大鼠對電流強度和電流時間的反應，確立合適的足底電擊程序。最后確定為給予大鼠1.2mA的電流，每120秒給予一個60秒的電擊，最后180秒自由活動，總共30min。所有的動物被隨機分為5組:1天組、7天組、14天組、28天組和對照組;②應用微透析實驗收集大鼠模型前及模型后1天和28天在BLA內(nèi)的細胞外液;③應用高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用和放射免疫技術，檢測透析液內(nèi)各神經(jīng)遞質(zhì)（包括腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-HT及其代謝

7、產(chǎn)物，皮質(zhì)酮和CRH，以及谷氨酸、天冬氨酸和乙酰膽堿）的含量;④應用放射免疫、免疫熒光和免疫組織化學的方法分別觀察透析液中CCK的含量，BLA內(nèi)CCK中間神經(jīng)元的數(shù)量，以及CCK受體的陽性表達。
　　結果:①通過大鼠對電流強度和電流時間的反應，我們確定在給予1.2 mA電流強度，10次60秒電擊的這種刺激方式下，大鼠不能消退環(huán)境相關的恐懼記憶。②在給與大鼠共30min的足底電擊程序（1.2mA的電流，每120秒給予一個60秒的電擊

8、，最后180秒自由活動）后，大鼠不動時間百分比（freezing％）可以從1天維持到28天并呈持續(xù)增長趨勢。③BLA內(nèi)的去甲腎上腺素、多巴胺在電擊后1天的水平有所增高，而腎上腺素無明顯變化。④BLA內(nèi)細胞外液的CRH分別在電擊后1天和28天均明顯高于基礎水平。⑤多巴胺的代謝產(chǎn)物DOPAC和、HVA，以及5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA在大鼠電擊前后的BLA內(nèi)并沒有明顯變化。⑥谷氨酸、天冬氨酸和乙酰膽堿在電擊后在BLA均有明顯升高，并且一

9、直伴隨著環(huán)境相關的恐懼記憶從1天一直持續(xù)到28天。⑦電擊后1天和28天的BLA細胞外液的CCK水平明顯增加;雙標的免疫熒光顯示了在BLA內(nèi)含有CCK的神經(jīng)元在給予足底電擊后CCK免疫活性明顯比電擊前增高;BLA神經(jīng)元內(nèi)CCK2受體免疫活性在電擊后1天和28天均明顯增加，而CCK1受體僅在28天有少量變化。
　　小結:本部分實驗成功建立了一個與創(chuàng)傷經(jīng)驗后的聯(lián)想恐懼有關的PTSD條件性恐懼大鼠模型。證明了應激相關神經(jīng)遞質(zhì)參與了PTSD

10、形成的起始。同時在條件恐懼的進展過程伴隨著CCK及其受體的高水平表達，與此同時與學習記憶相關的神經(jīng)遞質(zhì)參與了整個PTSD的發(fā)展過程。提示內(nèi)源性CCK系統(tǒng)可能是通過影響恐懼記憶參與了PTSD的形成和發(fā)展。
　　第二部分、CCK系統(tǒng)在條件性恐懼過程中的作用及其受體機制
　　目的:本部分實驗進一步觀察內(nèi)源性CCK是否通過其受體影響了恐懼記憶的獲得和表達，以及在該模型下是否改變了BLA內(nèi)的突觸結構可塑性，以明確內(nèi)源性CCK系統(tǒng)在恐懼

11、記憶的獲得和鞏固中的作用及機制。
　　方法:①應用在體RNAi技術，分別敲減CCK的1和2受體，觀察條件性恐懼大鼠模型的恐懼記憶的獲得和鞏固。②進一步通過對RNAi的大鼠進行自發(fā)活動測試、高架十字迷宮測試及Morris水迷宮測試來判斷其在自發(fā)活動、焦慮和空間學習記憶上有無變化。③應用高爾基染色的方法觀察內(nèi)源性CCK系統(tǒng)對條件性恐懼大鼠樹突棘密度的影響。④應用電鏡觀察內(nèi)源性CCK系統(tǒng)對條件性恐懼大鼠杏仁核BLA內(nèi)突觸超微結構的影響。

12、⑤應用液質(zhì)聯(lián)用觀察內(nèi)源性CCK系統(tǒng)對條件性恐懼大鼠杏仁核BLA內(nèi)谷氨酸、天冬氨酸和乙酰膽堿的影響。
　　結果:①CCK1R和CCK2R的siRNA在體干擾效率分別為65％和72％。最佳敲減時間為轉(zhuǎn)染后3天，后續(xù)的所有實驗均在轉(zhuǎn)染siRNA后3天進行。CCK1R和CCK2R在體干擾后CCK1R和CCK2R的蛋白表達水平明顯低于正常對照組，證明CCK受體敲減模型成功。②手術和轉(zhuǎn)染試劑對正常大鼠運動能力和恐懼反應均無影響。③對正常大鼠和

13、BLA內(nèi)CCK受體基因敲減的大鼠進行條件恐懼實驗，發(fā)現(xiàn)電擊1天或28天后，BLA內(nèi)CCK2受體敲減后的大鼠在足底電擊后1天和28天時不動時間百分比明顯降低，說明對BLA內(nèi)CCK2受體基因敲減能導致大鼠恐懼記憶的鞏固受損。同時發(fā)現(xiàn)電擊后1小時的各組大鼠不動時間百分比無明顯變化，以及每組足底電擊時間內(nèi)的每一次電擊后的各組大鼠不動時間百分均無明顯變化。說明BLA內(nèi)CCK受體基因的敲減不影響恐懼記憶的獲得。④BLA內(nèi)CCK2受體基因的敲減對動物

14、自發(fā)活動無影響;BLA內(nèi)CCK2受體基因的敲減不能使動物產(chǎn)生焦慮行為;BLA內(nèi)CCK2受體基因的敲減不能損害動物空間記憶。⑤雙側BLA內(nèi)注射CCK2受體的siRNA后的大鼠BLA內(nèi)的神經(jīng)元與正常大鼠的神經(jīng)元均排列整齊致密，細胞形態(tài)完整，邊界清晰，尼氏小體豐富，胞核大而圓，核仁清晰，基本沒有觀察到神經(jīng)損傷。⑥遭遇足底電擊后大鼠BLA內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)尤其是Glu、Asp和Ach均有明顯增加，但是僅有Glu和Asp能夠在CCK2受體基因的敲

15、減后有所下降。⑦在條件恐懼后28天，大鼠BLA內(nèi)的樹突棘密度和樹突長度明顯增加，但在BLA內(nèi)CCK2受體基因敲減后進行條件性恐懼，BLA內(nèi)的樹突棘密度和樹突長度與單純電擊組相比明顯減少。⑧條件性恐懼對突觸形態(tài)的影響:條件性恐懼后28天U型突觸數(shù)量、突觸后致密物的厚度及突觸前膜囊泡的數(shù)量均能顯著增加，但BLA內(nèi)CCK2受體基因敲減后突觸形態(tài)則無明顯變化。
　　小結:本部分實驗在第一部分實驗建立的條件性恐懼大鼠模型的基礎上，觀察了CC

16、K系統(tǒng)對大鼠條件性恐懼的影響。研究結果證實，BLA內(nèi)的CCK2受體是影響條件性恐懼記憶鞏固的關鍵環(huán)節(jié)，而且是通過改變BLA內(nèi)突觸的結構可塑性而發(fā)揮作用的。
　　第三部分、CCK2受體參與條件性恐懼過程中恐懼記憶鞏固的分子機制
　　目的:本部分研究在細胞水平通過激活原代杏仁核神經(jīng)元上的CCK2受體，觀察其下游信號轉(zhuǎn)導機制，以明確CCK2受體參與條件性恐懼記憶鞏固的機制。
　　方法:①培養(yǎng)大鼠原代杏仁核神經(jīng)元，免疫細胞化學

17、法對神經(jīng)元進行鑒定，及對原代杏仁核神經(jīng)元有無CCK及CCK2受體進行鑒定。②shRNA-CCK2R腺病毒載體的構建，及轉(zhuǎn)染到原代杏仁核神經(jīng)元，應用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。③應用CCK受體的高效激動劑CCK-8激活原代杏仁核神經(jīng)元的CCK2受體。④應用DiI染色法觀察CCK2受體對原代杏仁核神經(jīng)元樹突棘的影響。⑤應用非放射性標記法PKA檢測試劑盒，檢測CCK2受體激活后對原代杏仁核神經(jīng)元PKA活性的影響。⑥應用in cell we

18、stern的方法檢測CCK2受體對原代杏仁核神經(jīng)元內(nèi)CREB磷酸化的影響。⑦應用鈣成像檢測CCK2受體對原代杏仁核神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+的影響。⑧應用western blot法檢測CCK2受體對原代杏仁核神經(jīng)元內(nèi)CamkⅡ磷酸化和突觸素的影響。⑨應用western blot和免疫熒光檢測CCK2受體對原代杏仁核神經(jīng)元內(nèi)PSD95的影響。
　　結果:①用神經(jīng)元特異性標記物MAP-2多克隆抗體標記神經(jīng)元，結果顯示神經(jīng)元細胞純度＞90％;

19、激光共聚焦顯微鏡下顯示，原代杏仁核神經(jīng)元含有豐富的CCK2受體和CCK陽性表達。②pAD-CCK2R-shRNA構建成功，并且能夠應用于原代神經(jīng)元細胞，最佳MOI值為100時CCK2受體的干擾效率為71.4％。③CCK2受體激活后，原代杏仁核神經(jīng)元樹突的二級分支上的樹突棘密度明顯增高。④CCK2受體激活后通過使PKA活性升高進一步增加原代杏仁核神經(jīng)元細胞內(nèi)CREB磷酸化。⑤CCK2受體激活后能刺激原代杏仁核神經(jīng)元細胞的內(nèi)鈣釋放，而引起細

20、胞內(nèi)鈣增多，從而引起CamkⅡ磷酸化水平增加。⑥CCK2受體激活能增加原代杏仁核神經(jīng)元細胞內(nèi)突觸素和PSD95的表達從而影響杏仁核神經(jīng)元突觸結構可塑性的變化。
　　小結:本部分實驗在體外通過培養(yǎng)大鼠的原代杏仁核神經(jīng)元，探討了CCK2受體引起杏仁核神經(jīng)元突觸重塑及結構可塑性的重要機制。CCK2受體可以通過激活cAMP-PKA-CREB及Ga2+-CaMKⅡ-CREB信號轉(zhuǎn)導通路介導PSD95和的突觸素翻譯增多從而使杏仁核樹突棘結構改

21、變。同時也可能由于CCK2受體介導的CaMKⅡ Thr-262位點的自身磷酸化引起杏仁核神經(jīng)元突觸后致密物質(zhì)的變化，引起杏仁核神經(jīng)元突觸結構可塑性的改變。
　　結論:本實驗系統(tǒng)研究了CCK受體對創(chuàng)傷后應激障礙大鼠恐懼記憶的影響，并對其觸發(fā)的BLA神經(jīng)元突觸結構可塑性的機制加以深入探討，得出以下結論:
　　成功建立了一個與創(chuàng)傷經(jīng)驗后的聯(lián)想恐懼有關的PTSD條件性恐懼大鼠模型，在此模型基礎上證明了內(nèi)源性的CCK系統(tǒng)可能是通過影響