CCK系統(tǒng)在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠條件恐懼記憶中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（Posttraumatic stress disorder，PTSD）是慢性的精神障礙性疾病，病因是由于遭受應(yīng)激和創(chuàng)傷經(jīng)歷造成的，如家庭暴力、自然災(zāi)害或戰(zhàn)爭(zhēng)等相關(guān)的創(chuàng)傷。PTSD是以過度恐懼為特征的，并伴隨敏感性增高，從而損害生活質(zhì)量，并且引起多種疾病、社會(huì)和職業(yè)問題。目前，人們常把PTSD定義為焦慮障礙性疾病，但大量研究證明PTSD更適合歸為學(xué)習(xí)和記憶障礙類的疾病，因?yàn)樗謶钟洃浀倪^度鞏固和消退的受損?？謶址磻?yīng)的改

2、變可能導(dǎo)致侵入性記憶和倒敘，增強(qiáng)了回避提示線索和自主覺醒癥狀。許多研究證明杏仁核是影響PTSD的關(guān)鍵核團(tuán)。尤其是杏仁核基底外側(cè)核(BLA)對(duì)于情感記憶的形成非常重要，在條件恐懼的獲得和表達(dá)中起重要作用。所以，目前BLA在PTSD的研究中更受關(guān)注。
　　在過去的研究中，膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)被認(rèn)為是與學(xué)習(xí)記憶、焦慮和恐懼等腦高級(jí)活動(dòng)有密切關(guān)系的神經(jīng)肽類物質(zhì)。CCK及其受體在大腦中廣泛分布，如，皮質(zhì)、海馬

3、和杏仁核等。過去的一些研究證實(shí)了在BLA內(nèi)的神經(jīng)元存在高濃度的CCK和CCK mRNA。杏仁核內(nèi)的CCK陽(yáng)性神經(jīng)元對(duì)調(diào)節(jié)錐體神經(jīng)元的興奮性和突觸的整合具有很強(qiáng)的作用。以往的研究證明激活BLA內(nèi)的CCK受體可以損傷恐懼記憶的消退。動(dòng)物模型和人類影像學(xué)研究證據(jù)表明PTSD的一個(gè)潛在機(jī)制就是突觸可塑性的異常。而先前的研究也已表明CCK可以增強(qiáng)海馬的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)并且增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間記憶能力。所以我們有理由認(rèn)為CCK系統(tǒng)與PTSD的形成機(jī)制密切相

4、關(guān)。然而，BLA內(nèi)的CCK系統(tǒng)對(duì)PTSD的形成機(jī)制的影響尚無(wú)深入研究。
　　過去的數(shù)據(jù)表明PTSD需要從病因研究入手，因?yàn)榭謶钟洃浀钠鹗寂c巴普洛夫條件恐懼有相似的過程。因此我們建立了環(huán)境相關(guān)的條件恐懼模型作為PTSD的動(dòng)物模型。在此模型的基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步探討了BLA內(nèi)CCK系統(tǒng)在PTSD發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，同時(shí)在細(xì)胞水平上明確CCK受體在引起PTSD相關(guān)癥狀后的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。以期為臨床治療PTSD選擇有效的靶點(diǎn)提供生物

5、學(xué)依據(jù)。
　　第一部分、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠杏仁核內(nèi)CCK系統(tǒng)及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化
　　目的:以巴甫洛夫條件模型為基礎(chǔ)建立與PTSD恐懼癥狀相關(guān)的動(dòng)物模型;在此模型的基礎(chǔ)上觀察給予厭惡刺激后內(nèi)源性CCK系統(tǒng)的變化，包括細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)CCK水平，以及CCK受體;同時(shí)也觀察了給予厭惡刺激后其他相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的變化，包括兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，HPA軸的相關(guān)遞質(zhì)，以及與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)。
　　方法:①建立PTSD

6、的動(dòng)物模型，通過大鼠對(duì)電流強(qiáng)度和電流時(shí)間的反應(yīng)，確立合適的足底電擊程序。最后確定為給予大鼠1.2mA的電流，每120秒給予一個(gè)60秒的電擊，最后180秒自由活動(dòng)，總共30min。所有的動(dòng)物被隨機(jī)分為5組:1天組、7天組、14天組、28天組和對(duì)照組;②應(yīng)用微透析實(shí)驗(yàn)收集大鼠模型前及模型后1天和28天在BLA內(nèi)的細(xì)胞外液;③應(yīng)用高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用和放射免疫技術(shù)，檢測(cè)透析液內(nèi)各神經(jīng)遞質(zhì)（包括腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、5-HT及其代謝

7、產(chǎn)物，皮質(zhì)酮和CRH，以及谷氨酸、天冬氨酸和乙酰膽堿）的含量;④應(yīng)用放射免疫、免疫熒光和免疫組織化學(xué)的方法分別觀察透析液中CCK的含量，BLA內(nèi)CCK中間神經(jīng)元的數(shù)量，以及CCK受體的陽(yáng)性表達(dá)。
　　結(jié)果:①通過大鼠對(duì)電流強(qiáng)度和電流時(shí)間的反應(yīng)，我們確定在給予1.2 mA電流強(qiáng)度，10次60秒電擊的這種刺激方式下，大鼠不能消退環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶。②在給與大鼠共30min的足底電擊程序（1.2mA的電流，每120秒給予一個(gè)60秒的電擊

8、，最后180秒自由活動(dòng)）后，大鼠不動(dòng)時(shí)間百分比（freezing％）可以從1天維持到28天并呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。③BLA內(nèi)的去甲腎上腺素、多巴胺在電擊后1天的水平有所增高，而腎上腺素?zé)o明顯變化。④BLA內(nèi)細(xì)胞外液的CRH分別在電擊后1天和28天均明顯高于基礎(chǔ)水平。⑤多巴胺的代謝產(chǎn)物DOPAC和、HVA，以及5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA在大鼠電擊前后的BLA內(nèi)并沒有明顯變化。⑥谷氨酸、天冬氨酸和乙酰膽堿在電擊后在BLA均有明顯升高，并且一

9、直伴隨著環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶從1天一直持續(xù)到28天。⑦電擊后1天和28天的BLA細(xì)胞外液的CCK水平明顯增加;雙標(biāo)的免疫熒光顯示了在BLA內(nèi)含有CCK的神經(jīng)元在給予足底電擊后CCK免疫活性明顯比電擊前增高;BLA神經(jīng)元內(nèi)CCK2受體免疫活性在電擊后1天和28天均明顯增加，而CCK1受體僅在28天有少量變化。
　　小結(jié):本部分實(shí)驗(yàn)成功建立了一個(gè)與創(chuàng)傷經(jīng)驗(yàn)后的聯(lián)想恐懼有關(guān)的PTSD條件性恐懼大鼠模型。證明了應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)參與了PTSD

10、形成的起始。同時(shí)在條件恐懼的進(jìn)展過程伴隨著CCK及其受體的高水平表達(dá)，與此同時(shí)與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)參與了整個(gè)PTSD的發(fā)展過程。提示內(nèi)源性CCK系統(tǒng)可能是通過影響恐懼記憶參與了PTSD的形成和發(fā)展。
　　第二部分、CCK系統(tǒng)在條件性恐懼過程中的作用及其受體機(jī)制
　　目的:本部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察內(nèi)源性CCK是否通過其受體影響了恐懼記憶的獲得和表達(dá)，以及在該模型下是否改變了BLA內(nèi)的突觸結(jié)構(gòu)可塑性，以明確內(nèi)源性CCK系統(tǒng)在恐懼

11、記憶的獲得和鞏固中的作用及機(jī)制。
　　方法:①應(yīng)用在體RNAi技術(shù)，分別敲減CCK的1和2受體，觀察條件性恐懼大鼠模型的恐懼記憶的獲得和鞏固。②進(jìn)一步通過對(duì)RNAi的大鼠進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)測(cè)試、高架十字迷宮測(cè)試及Morris水迷宮測(cè)試來(lái)判斷其在自發(fā)活動(dòng)、焦慮和空間學(xué)習(xí)記憶上有無(wú)變化。③應(yīng)用高爾基染色的方法觀察內(nèi)源性CCK系統(tǒng)對(duì)條件性恐懼大鼠樹突棘密度的影響。④應(yīng)用電鏡觀察內(nèi)源性CCK系統(tǒng)對(duì)條件性恐懼大鼠杏仁核BLA內(nèi)突觸超微結(jié)構(gòu)的影響。

12、⑤應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用觀察內(nèi)源性CCK系統(tǒng)對(duì)條件性恐懼大鼠杏仁核BLA內(nèi)谷氨酸、天冬氨酸和乙酰膽堿的影響。
　　結(jié)果:①CCK1R和CCK2R的siRNA在體干擾效率分別為65％和72％。最佳敲減時(shí)間為轉(zhuǎn)染后3天，后續(xù)的所有實(shí)驗(yàn)均在轉(zhuǎn)染siRNA后3天進(jìn)行。CCK1R和CCK2R在體干擾后CCK1R和CCK2R的蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，證明CCK受體敲減模型成功。②手術(shù)和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)正常大鼠運(yùn)動(dòng)能力和恐懼反應(yīng)均無(wú)影響。③對(duì)正常大鼠和

13、BLA內(nèi)CCK受體基因敲減的大鼠進(jìn)行條件恐懼實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電擊1天或28天后，BLA內(nèi)CCK2受體敲減后的大鼠在足底電擊后1天和28天時(shí)不動(dòng)時(shí)間百分比明顯降低，說明對(duì)BLA內(nèi)CCK2受體基因敲減能導(dǎo)致大鼠恐懼記憶的鞏固受損。同時(shí)發(fā)現(xiàn)電擊后1小時(shí)的各組大鼠不動(dòng)時(shí)間百分比無(wú)明顯變化，以及每組足底電擊時(shí)間內(nèi)的每一次電擊后的各組大鼠不動(dòng)時(shí)間百分均無(wú)明顯變化。說明BLA內(nèi)CCK受體基因的敲減不影響恐懼記憶的獲得。④BLA內(nèi)CCK2受體基因的敲減對(duì)動(dòng)物

14、自發(fā)活動(dòng)無(wú)影響;BLA內(nèi)CCK2受體基因的敲減不能使動(dòng)物產(chǎn)生焦慮行為;BLA內(nèi)CCK2受體基因的敲減不能損害動(dòng)物空間記憶。⑤雙側(cè)BLA內(nèi)注射CCK2受體的siRNA后的大鼠BLA內(nèi)的神經(jīng)元與正常大鼠的神經(jīng)元均排列整齊致密，細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰，尼氏小體豐富，胞核大而圓，核仁清晰，基本沒有觀察到神經(jīng)損傷。⑥遭遇足底電擊后大鼠BLA內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)尤其是Glu、Asp和Ach均有明顯增加，但是僅有Glu和Asp能夠在CCK2受體基因的敲

15、減后有所下降。⑦在條件恐懼后28天，大鼠BLA內(nèi)的樹突棘密度和樹突長(zhǎng)度明顯增加，但在BLA內(nèi)CCK2受體基因敲減后進(jìn)行條件性恐懼，BLA內(nèi)的樹突棘密度和樹突長(zhǎng)度與單純電擊組相比明顯減少。⑧條件性恐懼對(duì)突觸形態(tài)的影響:條件性恐懼后28天U型突觸數(shù)量、突觸后致密物的厚度及突觸前膜囊泡的數(shù)量均能顯著增加，但BLA內(nèi)CCK2受體基因敲減后突觸形態(tài)則無(wú)明顯變化。
　　小結(jié):本部分實(shí)驗(yàn)在第一部分實(shí)驗(yàn)建立的條件性恐懼大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察了CC

16、K系統(tǒng)對(duì)大鼠條件性恐懼的影響。研究結(jié)果證實(shí)，BLA內(nèi)的CCK2受體是影響條件性恐懼記憶鞏固的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而且是通過改變BLA內(nèi)突觸的結(jié)構(gòu)可塑性而發(fā)揮作用的。
　　第三部分、CCK2受體參與條件性恐懼過程中恐懼記憶鞏固的分子機(jī)制
　　目的:本部分研究在細(xì)胞水平通過激活原代杏仁核神經(jīng)元上的CCK2受體，觀察其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以明確CCK2受體參與條件性恐懼記憶鞏固的機(jī)制。
　　方法:①培養(yǎng)大鼠原代杏仁核神經(jīng)元，免疫細(xì)胞化學(xué)

17、法對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，及對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元有無(wú)CCK及CCK2受體進(jìn)行鑒定。②shRNA-CCK2R腺病毒載體的構(gòu)建，及轉(zhuǎn)染到原代杏仁核神經(jīng)元，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。③應(yīng)用CCK受體的高效激動(dòng)劑CCK-8激活原代杏仁核神經(jīng)元的CCK2受體。④應(yīng)用DiI染色法觀察CCK2受體對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元樹突棘的影響。⑤應(yīng)用非放射性標(biāo)記法PKA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)CCK2受體激活后對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元PKA活性的影響。⑥應(yīng)用in cell we

18、stern的方法檢測(cè)CCK2受體對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元內(nèi)CREB磷酸化的影響。⑦應(yīng)用鈣成像檢測(cè)CCK2受體對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響。⑧應(yīng)用western blot法檢測(cè)CCK2受體對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元內(nèi)CamkⅡ磷酸化和突觸素的影響。⑨應(yīng)用western blot和免疫熒光檢測(cè)CCK2受體對(duì)原代杏仁核神經(jīng)元內(nèi)PSD95的影響。
　　結(jié)果:①用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2多克隆抗體標(biāo)記神經(jīng)元，結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞純度＞90％;

19、激光共聚焦顯微鏡下顯示，原代杏仁核神經(jīng)元含有豐富的CCK2受體和CCK陽(yáng)性表達(dá)。②pAD-CCK2R-shRNA構(gòu)建成功，并且能夠應(yīng)用于原代神經(jīng)元細(xì)胞，最佳MOI值為100時(shí)CCK2受體的干擾效率為71.4％。③CCK2受體激活后，原代杏仁核神經(jīng)元樹突的二級(jí)分支上的樹突棘密度明顯增高。④CCK2受體激活后通過使PKA活性升高進(jìn)一步增加原代杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)CREB磷酸化。⑤CCK2受體激活后能刺激原代杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)鈣釋放，而引起細(xì)

20、胞內(nèi)鈣增多，從而引起CamkⅡ磷酸化水平增加。⑥CCK2受體激活能增加原代杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)突觸素和PSD95的表達(dá)從而影響杏仁核神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性的變化。
　　小結(jié):本部分實(shí)驗(yàn)在體外通過培養(yǎng)大鼠的原代杏仁核神經(jīng)元，探討了CCK2受體引起杏仁核神經(jīng)元突觸重塑及結(jié)構(gòu)可塑性的重要機(jī)制。CCK2受體可以通過激活cAMP-PKA-CREB及Ga2+-CaMKⅡ-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)PSD95和的突觸素翻譯增多從而使杏仁核樹突棘結(jié)構(gòu)改

21、變。同時(shí)也可能由于CCK2受體介導(dǎo)的CaMKⅡ Thr-262位點(diǎn)的自身磷酸化引起杏仁核神經(jīng)元突觸后致密物質(zhì)的變化，引起杏仁核神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性的改變。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了CCK受體對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠恐懼記憶的影響，并對(duì)其觸發(fā)的BLA神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)可塑性的機(jī)制加以深入探討，得出以下結(jié)論:
　　成功建立了一個(gè)與創(chuàng)傷經(jīng)驗(yàn)后的聯(lián)想恐懼有關(guān)的PTSD條件性恐懼大鼠模型，在此模型基礎(chǔ)上證明了內(nèi)源性的CCK系統(tǒng)可能是通過影響