細菌纖維素(BC)基關節(jié)軟骨組織修復支架材料的制備及評價.pdf

1、木醋桿菌（A.xylinum）分泌的細菌纖維素（BC）是目前組織工程應用中最具前景的天然材料之一。因其獨特的纖維素成分及其三維納米纖維網絡結構，以水凝膠形式存在的BC被賦予了多種優(yōu)良的性能，如高力學強度、高吸水和保水性、高比表面積、微觀或宏觀結構可塑性、生物相容性以及生物可降解性等。通過與臨床應用所需的關節(jié)軟骨支架材料對比，BC顯示出極為符合的特性，已被研究者廣泛應用于關節(jié)軟骨組織修復領域。然而，BC單一的纖維素成分和致密的三維納米纖維

2、網絡結構而引起的生物活性低和細胞難以滲入的缺點，限制了BC在該領域的臨床應用。盡管國內外已有許多關于BC基支架材料表面理化性質和微觀結構改性的報道，但設計的工藝方法仍無法實現(xiàn)規(guī)?；a，且開發(fā)的產品性能未能滿足臨床應用的要求。因此，今后的研究重點為調控BC表面組成成分和三維微觀結構，以開發(fā)臨床應用關節(jié)軟骨支架材料為目標，建立和完善改性BC基支架材料的工藝路線和體外細胞評價體系。
　　因此，本論文針對現(xiàn)有BC基關節(jié)軟骨支架材料在表面

3、理化性質和微觀結構的改性技術和產品上所存在的問題采取以下解決方法：
　?。?）將A.xylinum接種于糊化藕粉（LRS）發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用簡易的生物合成法制備了BC/LRS復合支架材料，改善了BC作為關節(jié)軟骨支架材料的生物相容性。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的可以提高BC的產率，促進密集纖維絲束在復合支架材料的形成。隨著濃度逐漸上升，糊化藕粉反而降低BC的產率，同時改變復合支架材料的微觀形態(tài)，并產生層狀纖維結構。通過XRD、熱重以及力學性能

4、測試結果發(fā)現(xiàn)，糊化藕粉的添加對BC/LRS復合支架材料的結晶度、熱穩(wěn)定性以及力學性能產生顯著的影響。通過體外細胞Live/Dead分析結果表明，BC/LRS復合支架材料具有較高的細胞活性值，意味著藕粉的存在促進了BC基支架材料的細胞生物相容性。而與其他BC/淀粉復合支架材料對比時，可發(fā)現(xiàn)BC/LRS復合支架材料能夠支撐更多的細胞生長。此外，利用共聚焦顯微鏡還觀察到，經過14d的培植后，關節(jié)軟骨細胞可在BC/LRS復合支架材料上形成成熟的

5、伸展形態(tài)。這些結果表明，利用生物合成法制備的BC/LRS復合支架材料具有可控的物化性能和改良的細胞生物相容性，拓展了BC作為關節(jié)軟骨修復支架材料的應用前景。
　?。?）通過在BC表面分別引入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和海藻酸鈉（SA）兩種修飾物質，然后利用仿生礦化法制備了BC/羥基磷灰石（BC/HA）復合支架材料，達到了模擬關節(jié)軟骨鈣化層的細胞外基質（ECM）和縮短BC支架材料礦化時間的目的。結果表明，PVP和SA因所具有的極性基團

6、對Ca2+產生穩(wěn)定的吸附作用，加速了HA在BC表面的成核，同時縮短了復合支架材料的礦化時間。而利用PVP修飾BC時，所得到的HA晶體為棒狀形態(tài)。相比之下，經SA修飾后，該晶體呈現(xiàn)理想的球形形貌。通過FTIR-ATR圖譜結果顯示，在BC/HA復合支架材料上的HA晶體為CO32+離子摻雜型，并類似于人體HA的組成成分。元素分析結果表明 HA在支架材料上的含量隨著礦化時間的增長而逐漸上升，尤其是在BC-PVP-SBF和BC-SA-SBF復合支

7、架材料上，其含量值相對較高。同時HA晶體的Ca/P摩爾比處于1.37到1.57之間，表明合成的HA為缺鈣型晶相。通過共聚焦顯微鏡的觀察和堿性磷酸酶活性的測試結果表明，關節(jié)軟骨細胞在BC-SA-SBF支架材料上的能夠最早地顯現(xiàn)成熟的細胞形態(tài)，且具有更好的細胞分化能力。
　?。?）利用新型簡單的表面活性劑輔助偶氮二甲酰胺(AC)發(fā)泡技術，改造了BC支架材料的致密微孔結構，解決了現(xiàn)有致孔技術難以實現(xiàn)規(guī)?；a的問題。通過借助BC三維網絡

8、互穿通道，AC以溶解在堿性水溶液的形式，與BC纖維絲束形成均勻粘附。結果發(fā)現(xiàn)，當利用表面活性劑Tween80輔助AC發(fā)泡時，可在成型的BC支架材料上構建均一、連續(xù)的大孔結構（尺寸大小約為20μm）。相比于純BC支架材料來說，致孔后的BC支架材料介孔比表面積能夠從56.87 m2/g上升至169.86 m2/g，孔隙率從28.3％提高至90.8%，最大吸水率也從997%增長到7611%。通過體外細胞生物相容性分析結果表明，多孔BC支架材料

9、因其孔隙率和孔體積的增加，在細胞培養(yǎng)的過程中能吸取更多的營養(yǎng)液和加速代謝物的傳輸，促進了植入細胞的生長、分化和繁殖。然而，盡管多孔BC支架材料在孔隙率方面滿足了臨床應用的要求，但所具有的孔徑仍無法達到理想的尺寸大小，因此還需要對BC致孔工藝路線進行重新思考。
　?。?）采用微流體技術制備結構規(guī)整和大小均一的瓊脂糖微球，并以此作為致孔劑在活性BC基質生物反應器上合成孔徑尺寸為300-500μm以及孔結構相互貫穿的三維多孔BC關節(jié)軟骨

10、支架材料，解決了上述AC發(fā)泡致孔工藝難以擴大孔徑的缺點以及現(xiàn)有致孔劑濾出法中致孔劑大小均勻性差、支架材料宏觀形態(tài)不可控的限制問題。結果顯示，三維多孔BC支架材料不僅能夠實現(xiàn)關節(jié)軟骨細胞的內部滲入、轉移和復制的目標，還能展現(xiàn)出較高的細胞活性值。尤其是經過14 d的培育后，關節(jié)軟骨細胞能夠均勻地分布在整個支架材料上并使其形成活性預移植體。因此基于結合微流體和生物發(fā)酵技術的優(yōu)勢，開發(fā)了一種新型靈活的BC支架材料致孔技術，實現(xiàn)了BC孔結構尺寸可

11、控筑造以及細胞三維分布生長的目標，拓展了多孔BC支架材料在關節(jié)軟骨組織修復領域的應用前景。
　　總而言之，本論文通過生物合成法成功制備一系列BC/LRS復合支架材料，簡化了工藝流程步驟，調控了復合支架材料的微觀結構且改善了支架材料的生物相容性。利用PVP和SA修飾BC表面，通過仿生礦化法制備了BC/HA復合支架材料，提高了HA晶體的成核速度且縮短了復合支架材料的礦化時間。通過模擬關節(jié)軟骨鈣化層的ECM，BC/HA復合支架材料對植入

12、的關節(jié)軟骨細胞產生良好的生物活性和分化促進作用。為改造BC致密的網絡結構，采用表面活性劑輔助AC發(fā)泡技術，在成型BC支架材料上構造了穩(wěn)定均一的大孔結構。相比之前報道的致孔方法，這種新型發(fā)泡技術更為簡單、有效和高產。將微流體制備的瓊脂糖微球作為致孔劑鋪散在活性BC基質上，發(fā)酵培養(yǎng)2 d后，獲得具有孔結構大小為300-500μm且連續(xù)貫通的三維BC大孔支架材料。結果發(fā)現(xiàn)，關節(jié)軟骨細胞不僅能夠在最初植入過程中滲入到支架材料的內部，還能在培育過