人表皮生長(zhǎng)因子在干酪乳桿菌中的表達(dá)及其活性檢測(cè).pdf

1、腸道微生物群通過調(diào)控營(yíng)養(yǎng)吸收、抑制病原菌定植及刺激黏膜免疫等方式對(duì)宿主健康產(chǎn)生重要影響。作為人及哺乳動(dòng)物胃腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸菌能抑制病原菌對(duì)腸道上皮的粘附、預(yù)防炎癥，因此能有效預(yù)防腸道疾病。表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)是一種調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化的生長(zhǎng)因子，應(yīng)用于外傷治療及輔助腸道感染修復(fù)中，效果顯著。研究表明干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，L.casei)能預(yù)防腸道疾病

2、感染。實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建多種干酪乳桿菌表達(dá)質(zhì)粒，并成功表達(dá)異源蛋白。本研究擬構(gòu)建表達(dá)人EGF(hEGF)的重組干酪乳桿菌，研究干酪乳桿菌作為黏膜免疫活菌疫苗傳遞載體，原位表達(dá)特定蛋白的可行性，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:
　　SOE PCR合成Genbank報(bào)道的hEGF基因序列，克隆到三種表達(dá)載體上:胞內(nèi)表達(dá)載體pELX1;以Spusp45為分泌信號(hào)構(gòu)成的分泌表達(dá)載體pELSH;以SlpA蛋白作為信號(hào)進(jìn)行表面展示的干

3、酪乳桿菌表達(dá)載體pELWH。獲得能夠組成型表達(dá)hEGF蛋白的重組菌。經(jīng)Western blot分析，只在重組菌L.casei/pEL WH-hEGF的胞內(nèi)、細(xì)胞表面及培養(yǎng)液上清中檢測(cè)到SlpA-hEGF融合蛋白，分子量約55 kDa。
　　體外培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞，以L casei、L.casei/pEL WH為對(duì)照，添加L.casei/pELWH-hEGF培養(yǎng)液上清，觀察SlpA-hEGF對(duì)底物細(xì)胞的增殖活性

4、。結(jié)果表明SlpA-hEGF能促進(jìn)細(xì)胞增殖，稀釋10倍的L.casei/pELWH-hEGF上清的增殖效果與10 ng/mL的hEGF標(biāo)品效果相同，此外在L.casei和L.casei/pELWH中也觀察到了顯著的促細(xì)胞增殖現(xiàn)象。
　　為檢測(cè)重組菌對(duì)小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，選取體重18-22 g清潔級(jí)雌性小鼠，每天灌胃重組菌L.casei/pELWH-hEGF全培養(yǎng)液，設(shè)計(jì)空白對(duì)照(CK)、PBS、MRS、干酪乳桿菌全培養(yǎng)液(L.

5、.casei)、空載體全培養(yǎng)液(L.casei/pELWH)對(duì)照組。結(jié)果表明MRS組十二指腸的絨毛高度極顯著高于PBS組(P＜0.01)，L.casei組與MRS組相比極顯著提高了小鼠十二指腸絨毛高度(P＜0.01），pELWH-hEGF組與L.casei組、pELWH組相比極顯著提高了小鼠十二指腸絨毛高度(P＜0.01），各處理組空腸高度、回腸高度及十二指腸、空腸、回腸隱窩深度差異在本試驗(yàn)中未達(dá)顯著水平。
　　本研究為干酪乳桿菌