豆科植物蒺藜苜蓿發(fā)育相關(guān)基因LOBED LEAFLET1和STAY-GREEN的鑒定.pdf

1、豆科(Leguminosae)是種子植物第三大科,用途廣泛,栽培歷史長(zhǎng),是人類(lèi)和動(dòng)物食物和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的最重要的科屬之一。豆科植物與根瘤菌之間的共生固氮系統(tǒng)是生物圈中氮循環(huán)的一個(gè)主要氮源。
　　 與其他豆科物種相比,蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)具有遺傳轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)周期短、染色體數(shù)目少、基因組小、嚴(yán)格自花授粉、固氮等特點(diǎn),已成為豆科生物學(xué)和基因組學(xué)研究的新型模式植物。十多年來(lái),已建立了相關(guān)的蒺藜苜?；蚪M生物

2、信息學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)展了一系列能基因組研究工具和遺傳突變體庫(kù)。
　　 越來(lái)越多的研究已經(jīng)證明,小RNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色。目前,小RNA(small RNAs)研究最廣泛的是microRNA(miRNA)和smallinterfering RNA(siRNA)。miRNA主要為生物體內(nèi)源型小RNA:siRNA分為內(nèi)源與外源型小RNA,其中內(nèi)源型siRNA主要調(diào)控生物體的機(jī)能,而外源型siRNA主要是RNAi實(shí)驗(yàn)

3、進(jìn)行基因抑制的手段。內(nèi)源型siRNA的形成機(jī)制已比較清楚,其中TAS3 ta-siRNA是2005年才發(fā)現(xiàn)的一種新型調(diào)控途徑,在生長(zhǎng)發(fā)育等各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 本文從蒺藜苜蓿Tnt1突變體庫(kù)中篩選到了兩種發(fā)育相關(guān)突變體:
　　 (1)葉緣深鋸齒突變體lol1。從中克隆到與植物形態(tài)發(fā)育密切相關(guān)基因LOL1,它是植物內(nèi)源siRNA的TAS3 ta-siRNA調(diào)控途徑中的關(guān)鍵基因,對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育有直接或間接的影響；

4、
　　 (2)滯綠突變體sgr。從中克隆到葉綠素降解相關(guān)基因SGR,并且利用RNAi技術(shù)抑制牧草紫花苜蓿中內(nèi)源SGR基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系滯綠并且品質(zhì)有所改良:
　　 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.LOL1基因與TAS3 ta-siRNA途徑在蒺藜苜蓿發(fā)育過(guò)程中的作用
　　 在篩選蒺藜苜蓿Tnt1突變體庫(kù)時(shí),發(fā)現(xiàn)了四個(gè)具相同表型的發(fā)育突變體lobed leaflet1(lol1),在葉、花和根的

5、發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷:成年葉邊緣產(chǎn)生嚴(yán)重的缺刻,幼年葉呈現(xiàn)出成年葉的特征；花器官的發(fā)育也不正常,其花瓣呈放射狀,中央心皮不能融合從而導(dǎo)致胚珠暴露,花粉囊和花粉顆粒大小不均一,花粉內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生降解,在開(kāi)花后期,花粉囊無(wú)法正常打開(kāi):主根長(zhǎng)度變短,但一級(jí)和二級(jí)側(cè)根的數(shù)量明顯增多。進(jìn)一步分析顯示,這四個(gè)突變體分別是Tnt1和內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Mere1插入到同一個(gè)基因外顯子的不同位置造成的；我們克隆了該基因,并命名為L(zhǎng)OL1。
　　

6、LOL1在蒺藜苜蓿野生型的各器官中均有表達(dá),其中花和莖中表達(dá)量最高,其次是葉柄、幼葉和成年葉,這表明該基因在葉和花的發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。RNA原位雜交結(jié)果證明,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,LOL1基因在葉原基和處于發(fā)育階段的葉近軸端部位表達(dá),而在莖頂端分生組織(shoot apical meristems,SAM)中沒(méi)有表達(dá)；生殖生長(zhǎng)階段,LOL1在花分生組織有表達(dá),其中在發(fā)育中的花藥、胚珠和心皮等花器官中表達(dá)量更高。
　　 lol1突變

7、體的互補(bǔ)系的發(fā)育缺陷被完全恢復(fù),并且能夠產(chǎn)生后代。qRT-PCR分析表明外源引入的LOL1基因在互補(bǔ)系中的表達(dá)量與野生型相似。過(guò)表達(dá)LOL1的蒺藜苜蓿轉(zhuǎn)基因株系的表型和野生型沒(méi)有明顯差別。
　　 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明LOL1氨基酸序列與擬南芥AGO7(ZIP)、水稻OsAGO7(SHL4)有高的同源性,聚為一組。另外,LOL1含有AGO蛋白的PAZ中心結(jié)構(gòu)域和C-端PIWI結(jié)構(gòu)域,表明是擬南芥AGO7的同源基因,其編碼的蛋白是TA

8、S3ta-siRNA途徑的關(guān)鍵蛋白。
　　 通過(guò)對(duì)蒺藜苜蓿TAS3 ta-siRNA途徑的預(yù)測(cè)和分析,得到了蒺藜苜蓿TAS3ta-siRNA基因,TAS3 ta-siRNA途徑中的miRNA-miR390,和三個(gè)靶基因ARF。結(jié)果表明,這一途徑的關(guān)鍵基因序列都與擬南芥、百脈根和水稻中的相關(guān)基因同源,且靶位點(diǎn)保守。這些結(jié)果表明TAS3 ta-siRNA-ARFs在調(diào)控單子葉和雙子葉植物發(fā)育過(guò)程中的功能非常保守。而且,蒺藜苜蓿lol

9、1突變體特有的根系統(tǒng)缺陷表明TAS3 ta-siRNA調(diào)控途徑在蒺藜苜蓿發(fā)育中可能發(fā)揮更加廣泛的作用。另外,HD-ZIPⅢ基因家族在lol1突變體中表達(dá)上調(diào),這說(shuō)明該基因家族被蒺藜苜蓿TAS3 ta-siRNA途徑間接調(diào)控。由于該基因家族控制植物側(cè)翼器官的發(fā)育,因此HD-ZIPⅢ基因家族表達(dá)水平的變化可能也是造成lol1突變體側(cè)根數(shù)目增多的原因之一。
　　 2.蒺藜苜蓿滯綠基因(STAY-GREEN)的鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)

10、從蒺藜苜蓿Tnt1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子突變體庫(kù)中還篩選到了滯綠(stay-green)突變體sgr,在葉片衰老的過(guò)程中仍保留葉綠素。研究發(fā)現(xiàn)Tnt1插入到了蒺藜苜蓿的滯綠(STAY-GREEN)基因MtSGR的第三個(gè)外顯子第131-132bp之間,導(dǎo)致基因失活。根據(jù)蒺藜苜蓿sgr突變體在衰老過(guò)程中葉綠素的保留、Fv√Fm指標(biāo)下降速率和類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)保留的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察結(jié)果,證明該突變體屬于C型滯綠突變體。
　　 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明蒺藜苜蓿SG

11、R(MtSGR)與紫花苜蓿(MsSGR)親緣關(guān)系最近。而且豌豆、大豆、紫花苜蓿、蒺藜苜蓿等豆科物種的SGR序列高度保守,聚為一個(gè)組。蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示,SGR家族成員蛋白質(zhì)有高度保守的中心序列,但N端和C端序列區(qū)域有顯著差別。蒺藜苜蓿sgr突變體中Tnt1插入位點(diǎn)Arg-145在SGR家族內(nèi)部是一個(gè)高度保守的氨基酸殘基,說(shuō)明該氨基酸是蛋白質(zhì)具有功能的保守氨基酸。
　　 MtSGR基因表達(dá)譜結(jié)果顯示,其在各器官中均為低水平組成型表

12、達(dá),但在種子成熟與根瘤發(fā)育,特別是在根瘤衰老的過(guò)程中,MtSGR的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,表明MtSGR的表達(dá)不僅與葉綠素衰老相關(guān),在根瘤發(fā)育和衰老途徑中也可能發(fā)揮功能。
　　 3.紫花苜蓿內(nèi)源SGR基因RNAi分析
　　 根據(jù)蒺藜苜蓿與紫花苜蓿間高度同源的進(jìn)化關(guān)系,克隆了紫花苜蓿MsSGR基因,并且利用RNAi技術(shù)對(duì)紫花苜蓿內(nèi)源MsSGR基因的表達(dá)進(jìn)行抑制,獲得了12個(gè)滯綠轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)real-time PCR分析,發(fā)現(xiàn)

13、5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)源SGR基因的抑制水平在60％以上。衰老誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明,這5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系表型與蒺藜苜蓿sgr突變體一致,屬于C型滯綠突變體。Southern雜交結(jié)果表明,這5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因事件,轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地整合到了紫花苜?；蚪M的不同區(qū)域。
　　 紫花苜蓿是一種重要的牧草,收割方式通常是將地上部分采收后捆包,晾干成干草。干草是目前最普遍的貯存草料的方法,能夠避免在收后貯藏時(shí)候草料質(zhì)量的損失。對(duì)紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行模擬

14、收割和干燥,發(fā)現(xiàn)在正常生長(zhǎng)環(huán)境下轉(zhuǎn)基因株系與野生型、對(duì)照株系沒(méi)有區(qū)別,但在干燥處理之后仍保持滯綠的特點(diǎn),因此在收割與收割后貯存上有明顯優(yōu)勢(shì)和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 牧草品質(zhì)分析表明,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系的牧草品質(zhì)沒(méi)有降低,甚至有一定的改進(jìn),比如SGRi-39株系的粗蛋白含量和消化度稍有少許提高,而耐酸性去污劑纖維(ADF)和中性去污劑纖維(NDF)含量則明顯下降,說(shuō)明MsSGR的下調(diào)表達(dá)對(duì)紫花苜蓿的牧草改良有正面貢獻(xiàn)。