氨等離子體錨定短肽組織工程骨的制備及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 大段骨缺損容易導(dǎo)致骨的延遲愈合或不愈合,是外傷造成殘疾的常見(jiàn)原因。由此帶來(lái)的家庭、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問(wèn)題不容忽視。自體骨移植一般被認(rèn)為是治療的金標(biāo)準(zhǔn),但它也存在明顯局限性。隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展,骨缺損的治療有了新的選擇。骨組織工程支架材料作為骨的臨時(shí)性替代物被植入缺損部位,要求它具有接近于自體骨的生物學(xué)特性。因此,尋找合適的骨替代材料就成為骨組織工程要解決的首要問(wèn)題。
　　 有機(jī)高分子聚合物材料聚乳酸(Po

2、ly-lactide acid,PLA)以其優(yōu)良的生物相容性和熱穩(wěn)定性、可控的機(jī)械強(qiáng)度、可降解且降解產(chǎn)物無(wú)毒等特性,早在上世紀(jì)70年代就被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床。其中,消旋聚乳酸(Poly-D,L-lactide acid,PDLLA)降解速率較快,更適宜選作骨組織工程支架材料。然而,PDLLA表面缺乏能與細(xì)胞跨膜整合素受體結(jié)合的生物活性位點(diǎn)。另外還存在親水性差、細(xì)胞吸附力弱等問(wèn)題,難以提供細(xì)胞和材料間交互作用的理想環(huán)境。針對(duì)這些問(wèn)題,

3、已有很多學(xué)者嘗試對(duì)PDLLA進(jìn)行表面修飾。常用方法如表面涂層、表面化學(xué)修飾、等離子體改性等。
　　 表面涂層通常在材料表面覆蓋細(xì)胞外基質(zhì)蛋白涂層,以模擬天然的細(xì)胞環(huán)境。缺點(diǎn)是耗時(shí)且造價(jià)昂貴,被動(dòng)的吸附可能競(jìng)爭(zhēng)性抑制其它物質(zhì)的吸收,可能改變涂層蛋白的分子構(gòu)型,最終導(dǎo)致生物活性被抑制或降低?；瘜W(xué)修飾的目的也是為了在人工支架材料表面引入生物活性分子,相比單純的物理吸附,材料表面能與生物活性分子間的化學(xué)鍵結(jié)合,結(jié)合效率更高,更為牢固。化

4、學(xué)修飾采用的各種偶聯(lián)技術(shù)確保活性肽與材料表面的共價(jià)接合,但仍面臨兩個(gè)問(wèn)題:(1)聚合物材料表面通常缺乏適宜的活性基團(tuán)；(2)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程繁瑣且不易控制,反應(yīng)試劑難以徹底除去,可能破壞材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
　　 等離子體改性技術(shù)能夠在不影響整體機(jī)械性能的前提下對(duì)材料表面進(jìn)行修飾。它能夠提高材料的粗糙度和表面能,并改善材料的親水性。利用特定的氣體,可以在材料表面引入特定的官能團(tuán),如氨基(-NH2)、羥基(-OH)等,這就為進(jìn)一步接合生物活

5、性分子(如膠原、活性肽段等)創(chuàng)造了條件。與化學(xué)修飾方法相比,等離子體改性具有工藝簡(jiǎn)單、易控制、無(wú)污染、不影響材料的整體性能、材料表面形狀不受限制和較強(qiáng)的滅菌消毒性能等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),它也存在活性基團(tuán)會(huì)隨時(shí)間消逝的問(wèn)題。
　　 生物活性人工骨支架,亦所謂“仿生”支架,是在體外構(gòu)建具備體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的支架材料。早期學(xué)者們自然想到利用細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)蛋白,如膠原(collagen)、層粘連

6、蛋白(laminin,LN)、纖連蛋白(fibronectin,FN)等進(jìn)行材料表面涂層。后來(lái)發(fā)現(xiàn),天然ECM蛋白分子易發(fā)生折疊而影響受體的識(shí)別,而來(lái)源于ECM蛋白長(zhǎng)鏈上的短肽序列比天然長(zhǎng)肽更穩(wěn)定,便于人工合成且效率較高。因此,研究開始傾向于在材料表面接枝活性短肽。最常用的肽序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD),它來(lái)源于ECM蛋白上的功能區(qū)域,是研究最廣泛、最有效的整合素配體。一旦RGD序列被整合素受體識(shí)別并

7、相結(jié)合,就啟動(dòng)了整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附過(guò)程,同時(shí)激活細(xì)胞與RGD之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,由此影響細(xì)胞在材料上的生物學(xué)行為,如增殖、分化、遷移、存活或者凋亡。
　　 本研究即探索在PDLLA骨支架材料表面接枝含RGD的生物活性短肽的簡(jiǎn)便、有效的方法,并觀察這種活性修飾PDLLA骨支架在體內(nèi)、外的成骨作用。利用氨等離子體改性技術(shù)賦予PDLLA表面活性-NH2,并進(jìn)一步與甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(Gly—Arg-Gly-As

8、p-Ser,GRGDS)短肽溶液縮合反應(yīng),達(dá)到材料表面以酰胺鍵接枝生物活性短肽的目的,使PDLLA獲得穩(wěn)定的生物活性,也克服了氨改性后材料表面活性基團(tuán)易于消逝的問(wèn)題。
　　 目的：
　　 1.探討運(yùn)用氨等離子體改性技術(shù),在PDLLA骨支架表面以酰胺鍵錨定GRGDS短肽的可行性。
　　 2.建立SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)體外分離、培養(yǎng)

9、和鑒定的方法；培養(yǎng)和鑒定SD大鼠慢病毒轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的BMSCs(RFP—BMSCs)。
　　 3.探討氨等離子體錨定GRGDS短肽的PDLLA骨支架上RFP-BMSCs的貼附、增殖、代謝與礦化,以及該活性修飾材料與BMSCs構(gòu)建的組織工程骨的體外成骨能力。
　　 4.建立SD大鼠股骨干8mm骨缺損模型,探討新型活性修飾PDLLA組織工程骨對(duì)該動(dòng)物模型的骨修復(fù)重

10、建能力。
　　 方法：
　　 1.氨等離子體錨定GRGDS短肽PDLLA骨支架的制備與檢測(cè)
　　 (1)PDLLA骨支架的制備
　　 參考本課題組的“模壓增強(qiáng)法”專利技術(shù),改良部分方法制備PDLLA三維支架。成品為直徑8 mm、高10mm的圓柱狀PDLLA三維骨支架。均勻切成厚約1 mm的圓片,備用。
　　 (2)表面氨基化PDLLA(Aminated PDLLA,A/PDLLA)的制備及檢測(cè)

11、r>　　 將圓片狀PDLLA三維支架材料置于等離子體處理儀的反應(yīng)室內(nèi),抽真空至10 Pa左右,充入氨氣至反應(yīng)室氣體壓力恒定為30 Pa。調(diào)節(jié)放電功率至50 W、頻率13.56 MHz,分別進(jìn)行2、5、10、20和30 min的等離子體改性處理。分別取經(jīng)過(guò)改性的實(shí)驗(yàn)組A/PDLLA和對(duì)照組PDLLA行表面形貌觀察、孔徑、孔隙率測(cè)定和表面接觸角測(cè)量。
　　 (3)表面FITC-GRGDS接枝PDLLA(Peptides conju

12、gated A/PDLLA,PA/PDLLA)的制備及檢測(cè)
　　 將A/PDLLA骨支架材料浸入含EDC.HCl和NHS的1 mg.mL FITC-GRGDS多肽溶液中室溫下低頻振蕩24 h,使材料表面的-NH2與FITC-GRGDS短肽S末端的-COOH縮合反應(yīng)。X射線光電子能譜(XPS)分析材料改性前后、接枝肽處理后表面元素組成、元素比值變化和各元素化學(xué)態(tài)變化。激光共聚焦顯微鏡和高效液相色譜(HPLC)分別定性、定量檢測(cè)FI

13、TC-GRGDS短肽的接枝情況。
　　 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 (1)原代SD大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 全骨髓貼壁法分離SD大鼠BMSCs,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。90％融合分瓶傳代。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。傳至P3的BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD44和CD45

14、的表達(dá)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色。
　　 (2)SD大鼠P3 RFP-BMSCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 復(fù)蘇SD大鼠P3 RFP-BMSCs,37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。90％融合分瓶傳代。倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。傳至P4的細(xì)胞,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色；成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)至脂滴出現(xiàn)較多、較大時(shí)進(jìn)行油紅O染色。

15、r>　　 3.GRGDS修飾的PDLLA骨支架與種子細(xì)胞的體外構(gòu)建
　　 (1)實(shí)驗(yàn)分組
　　 制備20 min氨改性A/PDLLA支架(A組)和20 min氨改性后接枝肽PA/PDLLA支架(PA組),以未經(jīng)處理的PDLLA支架(P組)作為對(duì)照。所有骨支架材料切成直徑8mm、厚1mm的圓片狀,備用。
　　 (2)與RFP-BMSCs的構(gòu)建及檢測(cè)
　　 各組材料接種成骨誘導(dǎo)后的RFP-BMSCs。接種細(xì)

16、胞后:①繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1d、2d、4d、6d、8d、10d、12d,CyQuant NF和AlamarBlue分別檢測(cè)支架上細(xì)胞的增殖和代謝活性；②繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d、14d、21d,倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞在材料上的增殖和貼附,鈣黃綠素礦化熒光染色觀察各組材料的體外成骨能力。
　　 (3)與BMSCs的構(gòu)建及檢測(cè)
　　 各組材料接種成骨誘導(dǎo)后的BMSCs,分別培養(yǎng)3d、7d、14d,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)骨鈣

17、素(Osteocalcin,OCN)、Ⅰ型膠原(Collgen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、ALP、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp-2)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)mRNA的表達(dá)變化；分別培養(yǎng)7d、14d、21d,進(jìn)行ALP活性測(cè)定；接種未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs,分別培養(yǎng)4d、8d,進(jìn)行掃描電鏡觀察。
　　 4.GRGDS修飾的PDLLA骨支架修復(fù)大鼠股骨干骨缺損

18、>　　 (1)實(shí)驗(yàn)分組
　　 體重350～500g的成年雄性SD大鼠45只,隨機(jī)分為3組,每組15只。以植入PA/PDLLA骨支架/BMSCs為實(shí)驗(yàn)組(PA/PDLLA組),PDLLA骨支架/BMSCs為對(duì)照組(PDLLA組),不植入材料和細(xì)胞的為空白對(duì)照組。術(shù)后飼養(yǎng)4、8、12周,每個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組各處死5只動(dòng)物取材。
　　 (2)SD大鼠股骨干骨缺損模型的建立
　　 細(xì)胞懸液以多點(diǎn)注射的方法接種于柱狀支架材料

19、,調(diào)整細(xì)胞懸液密度至2.0×107～3.0×107個(gè)細(xì)胞/mL,每個(gè)支架接種100μL。手術(shù)過(guò)程:動(dòng)物麻醉后,備皮、消毒、鋪巾,沿股骨干長(zhǎng)軸方向切開皮膚,逐層分離至股骨干,顯露近、遠(yuǎn)側(cè)干骺端。鉆孔,放置內(nèi)固定鋼板于股骨干外側(cè),近、遠(yuǎn)端各擰上兩枚螺釘。取下鋼板、螺釘,輪鋸截?cái)喙晒歉?形成約8mm骨缺損模型。不銹鋼板、螺釘固定股骨干骨缺損部位,不銹鋼絲加強(qiáng)內(nèi)固定。接種細(xì)胞的柱狀支架放置于骨缺損部位。
　　 (3)取材及觀察指標(biāo)

20、>　　 分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,取材行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.制備的骨支架及檢測(cè)結(jié)果
　　 (1)掃描電鏡觀察示支架材料內(nèi)部呈三維多孔且孔隙間互相連通的結(jié)構(gòu),各組所見(jiàn)無(wú)明顯差異?？讖健⒖紫堵矢鹘M間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。氨改性時(shí)間延長(zhǎng),表面水接觸角逐步下降。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,除20 min和30 min組之間P=0.08

21、8外,其余各組兩兩之間P<0.001。
　　 (2)氨改性處理的PDLLA支架出現(xiàn)Nls峰。改性時(shí)間延長(zhǎng),Nls峰漸趨明顯,20 min改性組達(dá)峰值。各處理時(shí)間的材料行肽接枝處理后,N元素比值相應(yīng)加大,并出現(xiàn)S2p峰。未經(jīng)處理的材料表面C峰可擬合為4個(gè)峰,經(jīng)過(guò)氨改性及接枝肽處理,在285.7和288.3 eV結(jié)合能位置可得到兩個(gè)新的擬合峰,分別歸屬為-C-NH-(氨基)和-C=O-NH-(酰胺基)。氨改性后材料表面存在以氨基為主

22、的含氮基團(tuán)。接枝肽處理后,材料表面氨基含量下降,酰胺基含量上升。
　　 (3)熒光共聚焦顯微鏡觀察空白對(duì)照組材料表面僅見(jiàn)極微弱綠色熒光。接枝肽各組材料表面熒光強(qiáng)度隨著氨改性時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng),20 min改性組最強(qiáng)?？瞻讓?duì)照組及接枝肽處理0、2、5 min組材料上的肽未被HPLC檢出；接枝肽處理10、20和30 min組可被檢出。接枝肽處理20 min組的肽量最多,30 min組次之,10 min組最少(F=71.578,P<

23、0.01)。三組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 (1)SD大鼠BMSCs、RFP-BMSCs在普通光鏡下觀察多為長(zhǎng)梭形或有2～3個(gè)突起；RFP-BMSCs在熒光鏡下觀察,細(xì)胞可激發(fā)出紅色熒光。BMSCs和RFP-BMSCs生長(zhǎng)曲線均呈S形。
　　 (2)BMSCs流式細(xì)胞儀表型鑒定示CD34、CD45雙陰性,CD29、CD44雙陽(yáng)性；BMS

24、Cs、RFP-BMSCs的ALP染色、茜素紅染色均呈陽(yáng)性；RFP-BMSCs油紅O染色陽(yáng)性。
　　 3.GRGDS修飾的PDLLA骨支架與種子細(xì)胞的體外構(gòu)建
　　 (1)接種RFP-BMSCs后各時(shí)間點(diǎn),三組材料上細(xì)胞均能增殖,組間細(xì)胞數(shù)量差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),PA組>A組>P組。除第10天(P=0.077)和第12天(P=0.491),PA組和A組間細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余各時(shí)間點(diǎn),PA組數(shù)量均

25、明顯高于A組。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),兩組間細(xì)胞數(shù)量逐漸接近。細(xì)胞代謝活性檢測(cè)與增殖檢測(cè)結(jié)果近似,骨支架上細(xì)胞增殖程度越高,其代謝越活躍。熒光顯微鏡觀察,A組和PA組材料上RFP-BMSCs較P組增殖活躍；鈣鹽沉積熒光染色顯示,第14天和第21天,綠色熒光強(qiáng)度PA組>A組>P組。
　　 (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果示:接種BMSCs后第3天,PA組各基因表達(dá)倍數(shù)均較P組高；除OCN外的各基因表達(dá)也均較A組高。第7天,A組OCN(13.1

26、3±1.28)、Col-Ⅰ(23.71±6.51)和OPN(27.4±7.17)mRNA表達(dá)倍數(shù)為最高,PA組次之。第14天,多數(shù)基因表達(dá)上調(diào),A組和PA組表達(dá)倍數(shù)較對(duì)照組明顯增高。PA組OCN(51.54±7.09)、ALP(24.26±3.41)和BMP-2(11.82±2.38)mRNA的表達(dá)較A組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ALP活性檢測(cè)結(jié)果示:A組和PA組ALP活性持續(xù)升高,P組活性第21天較第14天時(shí)略有下降。第7

27、天,A組和PA組之間ALP活性比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但均高于P組(P<0.01)；第14天和第21天,三組間ALP活性兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ALP活性PA組>A組>P組。掃描電鏡顯示,PA組材料能獲得較A組更好的細(xì)胞貼附,P組細(xì)胞較稀疏。
　　 4.GRGDS修飾的PDLLA骨支架修復(fù)大鼠股骨干骨缺損
　　 (1)PA/PDLLA組術(shù)后4W,骨斷端、材料內(nèi)部已可見(jiàn)少量的新生軟骨,有類骨樣組織出現(xiàn)。術(shù)后8W,

28、新生骨增多,出現(xiàn)成熟的骨細(xì)胞和編織骨。術(shù)后12W,新生骨逐漸改建,骨斷端與材料之間以大量的編織骨或成熟的板層骨連接,界限不清。X線檢查結(jié)果證實(shí),PA/PDLLA組在術(shù)后4W即見(jiàn)到絮狀高密度骨痂影,各時(shí)間點(diǎn)骨重建的影像學(xué)表現(xiàn),PA/PDLLA組均優(yōu)于PDLLA組。術(shù)后12W,PA/PDLLA組大量骨痂連接骨斷端與材料,密度均勻、致密,骨折線模糊。
　　 (2)術(shù)后12W,空白對(duì)照組、PDLLA組和PA/PDLLA組三組間OCN、C

29、ol-Ⅰ、ALP、BMP2和OPN的表達(dá)倍數(shù)差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。PDLLA組和PA/PDLLA組各基因表達(dá)倍數(shù)的95％可信區(qū)間(CI)均不包含1。各基因表達(dá)均以PA/PDLLA組為最高,PDLLA組次之,空白對(duì)照組最低。
　　 結(jié)論：
　　 1.氨等離子體改性氨等離子體改性能明顯促進(jìn)PDLLA表面以酰胺鍵接枝FITC-GRGDS活性短肽。
　　 2.全骨髓貼壁法能有效分離和擴(kuò)增SD大鼠B

30、MSCs。BMSCs符合干細(xì)胞表型特征,具有定向成骨誘導(dǎo)分化能力；RFP-BMSCs具有成骨、成脂誘導(dǎo)分化的能力。兩者均可用作骨組織工程的種子細(xì)胞。
　　 3.氨等離子體錨定GRGDS肽的活性修飾PDLLA骨支架,能明顯促進(jìn)RFP-BMSCs為種子細(xì)胞的貼附、增殖、代謝與礦化。單純氨等離子體改性能夠促進(jìn)骨支架上BMSCs早期向成骨細(xì)胞分化,而活性修飾PDLLA具有更好的促BMSCs體外成骨能力。
　　 4.氨等離子體錨定