氨等離子體錨定短肽組織工程骨的制備及實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 大段骨缺損容易導致骨的延遲愈合或不愈合,是外傷造成殘疾的常見原因。由此帶來的家庭、經(jīng)濟和社會問題不容忽視。自體骨移植一般被認為是治療的金標準,但它也存在明顯局限性。隨著骨組織工程技術的發(fā)展,骨缺損的治療有了新的選擇。骨組織工程支架材料作為骨的臨時性替代物被植入缺損部位,要求它具有接近于自體骨的生物學特性。因此,尋找合適的骨替代材料就成為骨組織工程要解決的首要問題。
　　 有機高分子聚合物材料聚乳酸(Po

2、ly-lactide acid,PLA)以其優(yōu)良的生物相容性和熱穩(wěn)定性、可控的機械強度、可降解且降解產(chǎn)物無毒等特性,早在上世紀70年代就被美國FDA批準用于臨床。其中,消旋聚乳酸(Poly-D,L-lactide acid,PDLLA)降解速率較快,更適宜選作骨組織工程支架材料。然而,PDLLA表面缺乏能與細胞跨膜整合素受體結合的生物活性位點。另外還存在親水性差、細胞吸附力弱等問題,難以提供細胞和材料間交互作用的理想環(huán)境。針對這些問題,

3、已有很多學者嘗試對PDLLA進行表面修飾。常用方法如表面涂層、表面化學修飾、等離子體改性等。
　　 表面涂層通常在材料表面覆蓋細胞外基質(zhì)蛋白涂層,以模擬天然的細胞環(huán)境。缺點是耗時且造價昂貴,被動的吸附可能競爭性抑制其它物質(zhì)的吸收,可能改變涂層蛋白的分子構型,最終導致生物活性被抑制或降低?；瘜W修飾的目的也是為了在人工支架材料表面引入生物活性分子,相比單純的物理吸附,材料表面能與生物活性分子間的化學鍵結合,結合效率更高,更為牢固?；?/p>

4、學修飾采用的各種偶聯(lián)技術確?；钚噪呐c材料表面的共價接合,但仍面臨兩個問題:(1)聚合物材料表面通常缺乏適宜的活性基團；(2)化學反應過程繁瑣且不易控制,反應試劑難以徹底除去,可能破壞材料內(nèi)部結構。
　　 等離子體改性技術能夠在不影響整體機械性能的前提下對材料表面進行修飾。它能夠提高材料的粗糙度和表面能,并改善材料的親水性。利用特定的氣體,可以在材料表面引入特定的官能團,如氨基(-NH2)、羥基(-OH)等,這就為進一步接合生物活

5、性分子(如膠原、活性肽段等)創(chuàng)造了條件。與化學修飾方法相比,等離子體改性具有工藝簡單、易控制、無污染、不影響材料的整體性能、材料表面形狀不受限制和較強的滅菌消毒性能等優(yōu)點。同時,它也存在活性基團會隨時間消逝的問題。
　　 生物活性人工骨支架,亦所謂“仿生”支架,是在體外構建具備體內(nèi)的細胞外基質(zhì)環(huán)境的支架材料。早期學者們自然想到利用細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)蛋白,如膠原(collagen)、層粘連

6、蛋白(laminin,LN)、纖連蛋白(fibronectin,FN)等進行材料表面涂層。后來發(fā)現(xiàn),天然ECM蛋白分子易發(fā)生折疊而影響受體的識別,而來源于ECM蛋白長鏈上的短肽序列比天然長肽更穩(wěn)定,便于人工合成且效率較高。因此,研究開始傾向于在材料表面接枝活性短肽。最常用的肽序列是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD),它來源于ECM蛋白上的功能區(qū)域,是研究最廣泛、最有效的整合素配體。一旦RGD序列被整合素受體識別并

7、相結合,就啟動了整合素介導的細胞粘附過程,同時激活細胞與RGD之間的信號轉導途徑,由此影響細胞在材料上的生物學行為,如增殖、分化、遷移、存活或者凋亡。
　　 本研究即探索在PDLLA骨支架材料表面接枝含RGD的生物活性短肽的簡便、有效的方法,并觀察這種活性修飾PDLLA骨支架在體內(nèi)、外的成骨作用。利用氨等離子體改性技術賦予PDLLA表面活性-NH2,并進一步與甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(Gly—Arg-Gly-As

8、p-Ser,GRGDS)短肽溶液縮合反應,達到材料表面以酰胺鍵接枝生物活性短肽的目的,使PDLLA獲得穩(wěn)定的生物活性,也克服了氨改性后材料表面活性基團易于消逝的問題。
　　 目的：
　　 1.探討運用氨等離子體改性技術,在PDLLA骨支架表面以酰胺鍵錨定GRGDS短肽的可行性。
　　 2.建立SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)體外分離、培養(yǎng)

9、和鑒定的方法；培養(yǎng)和鑒定SD大鼠慢病毒轉染紅色熒光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的BMSCs(RFP—BMSCs)。
　　 3.探討氨等離子體錨定GRGDS短肽的PDLLA骨支架上RFP-BMSCs的貼附、增殖、代謝與礦化,以及該活性修飾材料與BMSCs構建的組織工程骨的體外成骨能力。
　　 4.建立SD大鼠股骨干8mm骨缺損模型,探討新型活性修飾PDLLA組織工程骨對該動物模型的骨修復重

10、建能力。
　　 方法：
　　 1.氨等離子體錨定GRGDS短肽PDLLA骨支架的制備與檢測
　　 (1)PDLLA骨支架的制備
　　 參考本課題組的“模壓增強法”專利技術,改良部分方法制備PDLLA三維支架。成品為直徑8 mm、高10mm的圓柱狀PDLLA三維骨支架。均勻切成厚約1 mm的圓片,備用。
　　 (2)表面氨基化PDLLA(Aminated PDLLA,A/PDLLA)的制備及檢測

11、r>　　 將圓片狀PDLLA三維支架材料置于等離子體處理儀的反應室內(nèi),抽真空至10 Pa左右,充入氨氣至反應室氣體壓力恒定為30 Pa。調(diào)節(jié)放電功率至50 W、頻率13.56 MHz,分別進行2、5、10、20和30 min的等離子體改性處理。分別取經(jīng)過改性的實驗組A/PDLLA和對照組PDLLA行表面形貌觀察、孔徑、孔隙率測定和表面接觸角測量。
　　 (3)表面FITC-GRGDS接枝PDLLA(Peptides conju

12、gated A/PDLLA,PA/PDLLA)的制備及檢測
　　 將A/PDLLA骨支架材料浸入含EDC.HCl和NHS的1 mg.mL FITC-GRGDS多肽溶液中室溫下低頻振蕩24 h,使材料表面的-NH2與FITC-GRGDS短肽S末端的-COOH縮合反應。X射線光電子能譜(XPS)分析材料改性前后、接枝肽處理后表面元素組成、元素比值變化和各元素化學態(tài)變化。激光共聚焦顯微鏡和高效液相色譜(HPLC)分別定性、定量檢測FI

13、TC-GRGDS短肽的接枝情況。
　　 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 (1)原代SD大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 全骨髓貼壁法分離SD大鼠BMSCs,置于37℃、體積分數(shù)5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。90％融合分瓶傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長情況。MTT比色法繪制細胞生長曲線。傳至P3的BMSCs,流式細胞術檢測BMSCs表面標志物CD29、CD34、CD44和CD45

14、的表達；成骨誘導培養(yǎng)21d后行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色。
　　 (2)SD大鼠P3 RFP-BMSCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 復蘇SD大鼠P3 RFP-BMSCs,37℃、體積分數(shù)5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。90％融合分瓶傳代。倒置相差熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長情況。MTT比色法繪制細胞生長曲線。傳至P4的細胞,成骨誘導培養(yǎng)21d后行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色；成脂誘導液培養(yǎng)至脂滴出現(xiàn)較多、較大時進行油紅O染色。

15、r>　　 3.GRGDS修飾的PDLLA骨支架與種子細胞的體外構建
　　 (1)實驗分組
　　 制備20 min氨改性A/PDLLA支架(A組)和20 min氨改性后接枝肽PA/PDLLA支架(PA組),以未經(jīng)處理的PDLLA支架(P組)作為對照。所有骨支架材料切成直徑8mm、厚1mm的圓片狀,備用。
　　 (2)與RFP-BMSCs的構建及檢測
　　 各組材料接種成骨誘導后的RFP-BMSCs。接種細

16、胞后:①繼續(xù)成骨誘導培養(yǎng)1d、2d、4d、6d、8d、10d、12d,CyQuant NF和AlamarBlue分別檢測支架上細胞的增殖和代謝活性；②繼續(xù)成骨誘導培養(yǎng)7d、14d、21d,倒置相差熒光顯微鏡觀察細胞在材料上的增殖和貼附,鈣黃綠素礦化熒光染色觀察各組材料的體外成骨能力。
　　 (3)與BMSCs的構建及檢測
　　 各組材料接種成骨誘導后的BMSCs,分別培養(yǎng)3d、7d、14d,進行實時熒光定量PCR檢測骨鈣

17、素(Osteocalcin,OCN)、Ⅰ型膠原(Collgen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、ALP、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp-2)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)mRNA的表達變化；分別培養(yǎng)7d、14d、21d,進行ALP活性測定；接種未經(jīng)成骨誘導的BMSCs,分別培養(yǎng)4d、8d,進行掃描電鏡觀察。
　　 4.GRGDS修飾的PDLLA骨支架修復大鼠股骨干骨缺損

18、>　　 (1)實驗分組
　　 體重350～500g的成年雄性SD大鼠45只,隨機分為3組,每組15只。以植入PA/PDLLA骨支架/BMSCs為實驗組(PA/PDLLA組),PDLLA骨支架/BMSCs為對照組(PDLLA組),不植入材料和細胞的為空白對照組。術后飼養(yǎng)4、8、12周,每個時間點,每組各處死5只動物取材。
　　 (2)SD大鼠股骨干骨缺損模型的建立
　　 細胞懸液以多點注射的方法接種于柱狀支架材料

19、,調(diào)整細胞懸液密度至2.0×107～3.0×107個細胞/mL,每個支架接種100μL。手術過程:動物麻醉后,備皮、消毒、鋪巾,沿股骨干長軸方向切開皮膚,逐層分離至股骨干,顯露近、遠側干骺端。鉆孔,放置內(nèi)固定鋼板于股骨干外側,近、遠端各擰上兩枚螺釘。取下鋼板、螺釘,輪鋸截斷股骨干,形成約8mm骨缺損模型。不銹鋼板、螺釘固定股骨干骨缺損部位,不銹鋼絲加強內(nèi)固定。接種細胞的柱狀支架放置于骨缺損部位。
　　 (3)取材及觀察指標

20、>　　 分別于相應時間點處死動物,取材行大體觀察、X線檢查、組織學檢查和實時熒光定量PCR檢測。
　　 結果：
　　 1.制備的骨支架及檢測結果
　　 (1)掃描電鏡觀察示支架材料內(nèi)部呈三維多孔且孔隙間互相連通的結構,各組所見無明顯差異?？讖健⒖紫堵矢鹘M間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。氨改性時間延長,表面水接觸角逐步下降。各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義,除20 min和30 min組之間P=0.08

21、8外,其余各組兩兩之間P<0.001。
　　 (2)氨改性處理的PDLLA支架出現(xiàn)Nls峰。改性時間延長,Nls峰漸趨明顯,20 min改性組達峰值。各處理時間的材料行肽接枝處理后,N元素比值相應加大,并出現(xiàn)S2p峰。未經(jīng)處理的材料表面C峰可擬合為4個峰,經(jīng)過氨改性及接枝肽處理,在285.7和288.3 eV結合能位置可得到兩個新的擬合峰,分別歸屬為-C-NH-(氨基)和-C=O-NH-(酰胺基)。氨改性后材料表面存在以氨基為主

22、的含氮基團。接枝肽處理后,材料表面氨基含量下降,酰胺基含量上升。
　　 (3)熒光共聚焦顯微鏡觀察空白對照組材料表面僅見極微弱綠色熒光。接枝肽各組材料表面熒光強度隨著氨改性時間的延長而明顯增強,20 min改性組最強?？瞻讓φ战M及接枝肽處理0、2、5 min組材料上的肽未被HPLC檢出；接枝肽處理10、20和30 min組可被檢出。接枝肽處理20 min組的肽量最多,30 min組次之,10 min組最少(F=71.578,P<

23、0.01)。三組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 (1)SD大鼠BMSCs、RFP-BMSCs在普通光鏡下觀察多為長梭形或有2～3個突起；RFP-BMSCs在熒光鏡下觀察,細胞可激發(fā)出紅色熒光。BMSCs和RFP-BMSCs生長曲線均呈S形。
　　 (2)BMSCs流式細胞儀表型鑒定示CD34、CD45雙陰性,CD29、CD44雙陽性；BMS

24、Cs、RFP-BMSCs的ALP染色、茜素紅染色均呈陽性；RFP-BMSCs油紅O染色陽性。
　　 3.GRGDS修飾的PDLLA骨支架與種子細胞的體外構建
　　 (1)接種RFP-BMSCs后各時間點,三組材料上細胞均能增殖,組間細胞數(shù)量差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.001),PA組>A組>P組。除第10天(P=0.077)和第12天(P=0.491),PA組和A組間細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義外,其余各時間點,PA組數(shù)量均

25、明顯高于A組。隨著時間的延長,兩組間細胞數(shù)量逐漸接近。細胞代謝活性檢測與增殖檢測結果近似,骨支架上細胞增殖程度越高,其代謝越活躍。熒光顯微鏡觀察,A組和PA組材料上RFP-BMSCs較P組增殖活躍；鈣鹽沉積熒光染色顯示,第14天和第21天,綠色熒光強度PA組>A組>P組。
　　 (2)實時熒光定量PCR結果示:接種BMSCs后第3天,PA組各基因表達倍數(shù)均較P組高；除OCN外的各基因表達也均較A組高。第7天,A組OCN(13.1

26、3±1.28)、Col-Ⅰ(23.71±6.51)和OPN(27.4±7.17)mRNA表達倍數(shù)為最高,PA組次之。第14天,多數(shù)基因表達上調(diào),A組和PA組表達倍數(shù)較對照組明顯增高。PA組OCN(51.54±7.09)、ALP(24.26±3.41)和BMP-2(11.82±2.38)mRNA的表達較A組高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ALP活性檢測結果示:A組和PA組ALP活性持續(xù)升高,P組活性第21天較第14天時略有下降。第7

27、天,A組和PA組之間ALP活性比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但均高于P組(P<0.01)；第14天和第21天,三組間ALP活性兩兩比較均有統(tǒng)計學意義,ALP活性PA組>A組>P組。掃描電鏡顯示,PA組材料能獲得較A組更好的細胞貼附,P組細胞較稀疏。
　　 4.GRGDS修飾的PDLLA骨支架修復大鼠股骨干骨缺損
　　 (1)PA/PDLLA組術后4W,骨斷端、材料內(nèi)部已可見少量的新生軟骨,有類骨樣組織出現(xiàn)。術后8W,

28、新生骨增多,出現(xiàn)成熟的骨細胞和編織骨。術后12W,新生骨逐漸改建,骨斷端與材料之間以大量的編織骨或成熟的板層骨連接,界限不清。X線檢查結果證實,PA/PDLLA組在術后4W即見到絮狀高密度骨痂影,各時間點骨重建的影像學表現(xiàn),PA/PDLLA組均優(yōu)于PDLLA組。術后12W,PA/PDLLA組大量骨痂連接骨斷端與材料,密度均勻、致密,骨折線模糊。
　　 (2)術后12W,空白對照組、PDLLA組和PA/PDLLA組三組間OCN、C

29、ol-Ⅰ、ALP、BMP2和OPN的表達倍數(shù)差異均有顯著的統(tǒng)計學意義(P均<0.001)。PDLLA組和PA/PDLLA組各基因表達倍數(shù)的95％可信區(qū)間(CI)均不包含1。各基因表達均以PA/PDLLA組為最高,PDLLA組次之,空白對照組最低。
　　 結論：
　　 1.氨等離子體改性氨等離子體改性能明顯促進PDLLA表面以酰胺鍵接枝FITC-GRGDS活性短肽。
　　 2.全骨髓貼壁法能有效分離和擴增SD大鼠B

30、MSCs。BMSCs符合干細胞表型特征,具有定向成骨誘導分化能力；RFP-BMSCs具有成骨、成脂誘導分化的能力。兩者均可用作骨組織工程的種子細胞。
　　 3.氨等離子體錨定GRGDS肽的活性修飾PDLLA骨支架,能明顯促進RFP-BMSCs為種子細胞的貼附、增殖、代謝與礦化。單純氨等離子體改性能夠促進骨支架上BMSCs早期向成骨細胞分化,而活性修飾PDLLA具有更好的促BMSCs體外成骨能力。
　　 4.氨等離子體錨定