浮游植物對(duì)海水酸度和鹽度下降及石油烴污染響應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、浮游植物是海洋主要初級(jí)生產(chǎn)者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起十分重要作用。由于溫室效應(yīng)氣體CO2的加劇排放，全球變暖、海冰融化、海平面上升，導(dǎo)致海洋酸度和鹽度下降。同時(shí)，隨著海上石油開(kāi)發(fā)及運(yùn)輸?shù)娜找姘l(fā)展，海洋石油泄露事故在全球各地頻發(fā)，石油烴污染已成為全球主要的海洋污染物之一。
　　本文針對(duì)海水酸度和鹽度下降及石油烴污染脅迫下，海洋浮游植物的生理生態(tài)響應(yīng)及其對(duì)微量元素生物地球化學(xué)循環(huán)的影響的科學(xué)問(wèn)題，以浮游植物生物量、抗氧

2、化能力、脂質(zhì)過(guò)氧化、光致產(chǎn)生活性氧等4種指標(biāo)來(lái)探討浮游植物的生理生態(tài)響應(yīng);首次以碳量子點(diǎn)(CDs)為示蹤劑標(biāo)記浮游植物細(xì)胞和熒光檢測(cè)劑檢測(cè)胞內(nèi)活性氧和銅的含量;探討海水酸度和鹽度下降及石油烴污染對(duì)其抗脅迫能力和微量元素?cái)z取的影響機(jī)制，獲得如下主要?jiǎng)?chuàng)新性結(jié)果:
　　1.構(gòu)建碳量子點(diǎn)熒光探針?lè)ǚ治龈∮沃参锇麅?nèi)外活性氧及金屬配合物生物可利用性
　　目前活性氧定量分析常用的有電子自旋共振、色譜及熒光分析等。然而，電子自旋共振和色譜分

3、析技術(shù)雖精度高，但存在需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)工作量大，受限因素多等缺陷。熒光分析技術(shù)因其快速準(zhǔn)確，靈敏度高，數(shù)據(jù)采集簡(jiǎn)化度高，顯微成像分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。此技術(shù)在生物及化學(xué)檢測(cè)中可被廣泛作為高靈敏的活性氧熒光探針。本實(shí)驗(yàn)基于CDs熒光信號(hào)穩(wěn)定、尺寸小，較其他的熒光量子點(diǎn)具有水溶性好、生物毒性低、易于大規(guī)模合成及功能化修飾、制備成本低廉和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢(shì)，可快速簡(jiǎn)單測(cè)定浮游植物胞內(nèi)外活性氧的含量。
　　應(yīng)用水楊酸表面修

4、飾的CDs(SA-CDs)，通過(guò)膜孔導(dǎo)入浮游植物細(xì)胞質(zhì)中，水楊酸與胞內(nèi)活性氧結(jié)合產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，其與FeCl3反應(yīng)，誘發(fā)熒光猝滅，據(jù)熒光信號(hào)變化值間接測(cè)定胞內(nèi)活性氧含量。SA-CDs表面酚羥基可與Fe3+快速反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物[Fe(C7H6O3)6]3-，該絡(luò)合物可被胞外活性氧誘導(dǎo)分解，顏色逐漸恢復(fù)至黃色，用比色法于波長(zhǎng)入525檢測(cè)胞外活性氧含量。胞內(nèi)和胞外檢測(cè)法均具線性范圍廣(6-9.6×105 ng·L-1和3-2400

5、 ng·L-1)、精密度高（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD6.38％和2.19％）、檢測(cè)限低(5.32 ng·L-1和1.21 ng·L-1)等優(yōu)勢(shì)。胞內(nèi)檢測(cè)法限比高效液相色譜法（同以水楊酸為捕獲劑）低105倍。胞外檢測(cè)法與PeroxiDetectTM Kit法檢測(cè)結(jié)果不存在顯著性差異且檢測(cè)限低28倍。
　　以CDs為熒光檢測(cè)劑，CDs對(duì)Cu2+具較高的選擇特異性，因Cu2+與CDs分子中的-COOH和-NH2作用形成不發(fā)熒光的配合物導(dǎo)致熒光

6、快速猝滅，據(jù)CDs熒光信號(hào)變化來(lái)測(cè)定胞內(nèi)Cu2+含量。此法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法（水質(zhì)銅的測(cè)定—2，9-二甲基-1，10-菲啰啉分光光度法）檢測(cè)結(jié)果不存在顯著性差異。將已標(biāo)記的威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii, CCMA-102)和小球藻(Chlorella vulgaris，CCMA-410)培養(yǎng)基中分別加入4種不同形態(tài)的銅(卟啉銅(Cu-Por)、鄰苯二甲酸銅(Cu-H2Lp)、Cu-EDTA和Cu2+)，各分兩

7、組（暗處理和光照組）。結(jié)果發(fā)現(xiàn):暗處理組兩種浮游植物胞內(nèi)CDs熒光僅能被Cu2+猝滅，說(shuō)明只有Cu2+能透過(guò)膜孔進(jìn)入胞內(nèi)與CDs結(jié)合;銅有機(jī)配合物可被光降解為Cu2+進(jìn)入胞內(nèi)，誘發(fā)CDs熒光猝滅，據(jù)熒光猝滅程度，可得配合物分解速率為Cu-Por＞Cu-H2Lp＞Cu-EDTA，與配合物的吸光能力(Por＞H2Lp＞ EDTA)和穩(wěn)定常數(shù)(KcCu-Por(5.92)＜Kc Cu-H2Lp(12-14)＜KcCu-EDTA(20.57))

8、分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，證實(shí)金屬只能以自由離子形態(tài)、被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)入浮游植物胞內(nèi)。
　　2.海水酸度和鹽度下降對(duì)威氏海鏈藻生理生態(tài)和微量金屬攝取量的影響
　　以無(wú)毒的威氏海鏈藻作為本研究的沿海硅藻模式種，以CDs為示蹤劑，通過(guò)細(xì)胞密度、蛋白質(zhì)、葉綠素a(Chla)、丙二醛(MDA)、超氧化岐化酶(SOD)、碳酸酐酶(CA)和光致產(chǎn)生活性氧等7個(gè)指標(biāo)探討鹽度(32.0、31.0、30.0、29.0)和酸度(8.10、8.00、7

9、.90、7.80)下降對(duì)硅藻生理生態(tài)指標(biāo)（如生物量、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、光合作用、脂質(zhì)過(guò)氧化、抗氧化能力和固碳能力）、微量金屬攝取量和抗脅迫能力的影響。
　　酸度下降對(duì)Chl a、MDA、蛋白質(zhì)和活性氧的影響，鹽度下降對(duì)細(xì)胞密度、銅和鎘攝取量的影響均存在顯著性差異(p＜0.05）。在單一或者耦合作用下，CA和SOD間呈正相關(guān)，但與其他指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;鹽度下降對(duì)銅、鎘和鋅間的影響均存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，如銅和鋅間的相關(guān)系數(shù)r高達(dá)0.989

10、;胞內(nèi)外活性氧之間亦呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.953，p＜0.05)。海水酸度和鹽度下降耦合對(duì)細(xì)胞密度、蛋白質(zhì)、Chl a、SOD、CA和鋅的影響呈拮抗效應(yīng)，而對(duì)MDA、銅和鎘的影響呈協(xié)同效應(yīng)。酸度和鹽度下降降低了藻細(xì)胞抗脅迫能力，低pH和低鹽度持續(xù)脅迫比脅迫終止后強(qiáng)，且增強(qiáng)隨酸度或鹽度下降呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)。
　　酸度和鹽度下降對(duì)威氏海鏈藻的影響是通過(guò)誘發(fā)藻體產(chǎn)生活性氧，從而降低生物量（抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、葉綠素a和蛋白質(zhì)合成）和固碳

11、能力（碳酸酐酶活性降低），促進(jìn)抗氧化能力(SOD酶活性增強(qiáng))和脂質(zhì)過(guò)氧化(MDA含量上升)。
　　3.石油烴污染對(duì)小球藻生理生態(tài)及微量元素?cái)z取量的影響
　　研究了小球藻在含或不含石油烴(WSF)培養(yǎng)基中30代不斷繁殖后細(xì)胞中β胡蘿卜素、Chl a、 SOD、 MDA、光致產(chǎn)生活性氧和微量元素?cái)z取量等影響，以CDs為示蹤劑，探討WSF對(duì)浮游植物生理生態(tài)指標(biāo)、微量元素可給性和抗脅迫能力的影響。
　　小球藻對(duì)WSF污染具很強(qiáng)

12、的適應(yīng)和耐受能力，且在持續(xù)脅迫環(huán)境下具更強(qiáng)的生存競(jìng)爭(zhēng)力。胞內(nèi)/外活性氧、β胡蘿卜素、·OH、MDA、SOD、錳和硒兩兩間均呈正相關(guān)關(guān)系，但與Chl a呈負(fù)相關(guān)。WSF對(duì)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期SOD活性、釩、錳和砷吸附量的影響均存在顯著性差異(p＜0.05，F(xiàn)＞Fα);當(dāng)WSF持續(xù)脅迫對(duì)處于兩種生長(zhǎng)周期的細(xì)胞中錳、硒吸收量和鎳、硒吸附量的影響，當(dāng)脅迫終止時(shí)對(duì)丙二醛含量的影響均存在顯著性差異。
　　本研究表明小球藻對(duì)石油烴污染具很強(qiáng)的適應(yīng)和耐