腸道微生物對(duì)Caco-2腸上皮細(xì)胞單層屏障作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:利用Caco-2腸上皮細(xì)胞單層屏障模型研究四種腸道微生物對(duì)腸道屏障的影響。
　　方法:建立Caco-2腸上皮細(xì)胞單層屏障模型，堿性磷酸酶檢測(cè)細(xì)胞極性。將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、大腸埃希菌組、肺炎克雷伯菌組、糞腸球菌組、乳酸桿菌組，在各組細(xì)菌作用下，Millicell-ERS電阻測(cè)定儀測(cè)定Caco-2腸上皮細(xì)胞單層跨上皮細(xì)胞電阻TEER值變化、酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光黃通過(guò)率的變化;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)單層細(xì)胞zonulin;電

2、鏡觀察細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)變化;免疫熒光、Westernblot方法檢測(cè)緊密連接(TJ)相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表達(dá)、分布和超微結(jié)構(gòu)變化。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:堿性磷酸酶測(cè)定細(xì)胞單層呈明顯極性，TEER值穩(wěn)定在250Ω·cm2，建模成功;腸道大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌均引起細(xì)胞單層屏障通透性升高，

3、TEER值明顯下降，熒光黃透過(guò)率增高，與對(duì)照組相比較差異顯著(P＜0.01);大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌作用后細(xì)胞釋放zonulin蛋白增加，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，糞腸球菌作用于Caco-2細(xì)胞單層后，zonulin釋放量較對(duì)照組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，乳酸桿菌組zonulin釋放量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);大腸埃希菌與單層細(xì)胞作用6小時(shí)后透射電子顯微鏡觀察單層細(xì)胞屏障可見(jiàn)細(xì)胞表面微絨毛變稀

4、，絨毛有脫落，細(xì)胞間緊密連接電子密度降低，斷裂，間隙增寬;大腸埃希菌組、肺炎克雷伯菌組三種緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表達(dá)明顯減少。糞腸球菌組、乳酸菌組Occludin、Claudin-1表達(dá)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，胞漿蛋白ZO-1表達(dá)降低。細(xì)菌作用6小時(shí)后免疫熒光觀察緊密連接蛋白分布情況，大腸埃希菌組和肺炎克雷伯菌組可見(jiàn)熒光較正常組松散，不連續(xù)，可見(jiàn)明顯鋸齒狀分布，甚至缺口及裂隙樣表現(xiàn)，熒光強(qiáng)度減弱，