微量液體處理技術(shù)的研究及其在自動(dòng)化核酸分析系統(tǒng)中的應(yīng)用.pdf

1、在全球化進(jìn)程不斷加強(qiáng)的背景下各種已知或未知疾病的大規(guī)模爆發(fā)事件不斷發(fā)生。一旦發(fā)生大規(guī)模的高致病性傳染病事件，如2002年爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)，大量疑似感染者需要在最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行確診，以便對(duì)疫情進(jìn)行準(zhǔn)確地評(píng)估與制定有效的防控措施。最為有效的辦法是利用更加快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高的高通量核酸檢測技術(shù)，通過檢測病人樣本中病原體的核酸序列完成快速確診，實(shí)現(xiàn)更短的檢測窗口期。
　　自動(dòng)化核酸分析系統(tǒng)作為核酸檢測技術(shù)的實(shí)

2、施平臺(tái)，其實(shí)現(xiàn)涉及到多項(xiàng)技術(shù)難題。其中，微量液體處理技術(shù)作為相關(guān)自動(dòng)化設(shè)備的核心技術(shù)之一，其準(zhǔn)確性與重復(fù)性將直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。雖然目前已報(bào)道了多種可用于微量液體操作的技術(shù)方案，但大都難以實(shí)際應(yīng)用。尤其是在液體特性差異較大，移液量程范圍較寬，及交叉污染極易發(fā)生的核酸檢測實(shí)驗(yàn)中，基于空氣置換式的移液方式仍然是實(shí)現(xiàn)此類自動(dòng)化設(shè)備的首選技術(shù)方案。
　　本論文首先研究了基于空氣置換式移液技術(shù)的原理，分析了微量移液過程中的多種影響因

3、素，并提出了基于液體特性的動(dòng)態(tài)校準(zhǔn)模型;同時(shí)，對(duì)自動(dòng)化液體處理技術(shù)中的液面檢測技術(shù)和移液過程實(shí)時(shí)監(jiān)控技術(shù)進(jìn)行了研究，并設(shè)計(jì)了以多通道空氣置換式移液模塊為核心的自動(dòng)化液體處理平臺(tái);在上述的研究基礎(chǔ)之上，構(gòu)建了高通量的核酸分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了臨床樣本的自動(dòng)化處理及分析。具體內(nèi)容包括:
　　1.空氣置換式微量移液技術(shù)的研究
　　研究了空氣置換式移液技術(shù)的基本原理，并根據(jù)ISO-8655及JJG646-2006標(biāo)準(zhǔn)建立了移液性能的測試平

4、臺(tái)及相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析方法;對(duì)影響移液性能的多種因素（環(huán)境因素、設(shè)備因素、操作因素及液體特性）進(jìn)行了分析，并根據(jù)這些因素的來源及影響程度提出了相應(yīng)的優(yōu)化措施;為進(jìn)一步提高移液性能，建立了基于液體特性（液體密度及粘稠度）的動(dòng)態(tài)校準(zhǔn)模型，經(jīng)校準(zhǔn)后的20μL移液器對(duì)于無水乙醇的移液誤差平均降低了3.3％，對(duì)于血液的移液誤差平均降低了0.93％。
　　2.自動(dòng)化液體處理技術(shù)的研究
　　首先對(duì)自動(dòng)化移液操作中的兩項(xiàng)關(guān)鍵輔助技術(shù)進(jìn)行了研究，

5、分別為:構(gòu)建了基于電容傳感器的液面檢測裝置，測量了吸液頭在不同狀態(tài)、不同液體類型的情況下的電容值變化，測得空氣中的電容值約為4.6 pF，液體為大于6.1 pF，據(jù)此可判斷出吸液頭在接觸液面時(shí)的高度;研究了基于氣壓傳感器的移液過程實(shí)時(shí)監(jiān)控技術(shù)，建立了基于純水操作的標(biāo)準(zhǔn)氣壓變化模型及其分析方法，據(jù)此設(shè)計(jì)了移液過程實(shí)時(shí)監(jiān)控程序，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種異常（如空吸、氣泡、堵塞等）操作的判別及記錄。其次，設(shè)計(jì)了基于空氣置換式的8通道微量移液模塊，并與機(jī)械

6、抓手模塊、機(jī)械臂定位系統(tǒng)一道構(gòu)成了自動(dòng)化的液體處理平臺(tái)。其中，8通道微量移液模塊的量程范圍為1～300μL，實(shí)驗(yàn)測得在20μL、100μL及200μL處的移液誤差分別為0.61％，0.75％和0.51％，重復(fù)性為0.62％，0.53％及0.56％（CV值）;機(jī)械臂定位系統(tǒng)的重復(fù)定位精度分別為30.71μm，27.10μm及23.60μm。以上性能均符合設(shè)計(jì)要求，可滿足自動(dòng)化液體處理的需求。
　　3.自動(dòng)化核酸分析系統(tǒng)的研發(fā)

7、　　按照高通量核酸分析實(shí)驗(yàn)的需求，將目標(biāo)系統(tǒng)分為樣本處理、核酸擴(kuò)增及信號(hào)檢測共三大部分。目標(biāo)系統(tǒng)以自動(dòng)化液體處理平臺(tái)為主體，通過集成相應(yīng)的功能模塊實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的核酸檢測流程。其中，多功能核酸提取模塊可在2小時(shí)內(nèi)完成對(duì)96個(gè)樣本的核酸提取操作，且不需要額外的轉(zhuǎn)板操作;高通量磁分離模塊提供了1個(gè)自動(dòng)化的磁分離工位、1個(gè)快速加熱工位及2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)SBS耗材工位，可對(duì)多種96孔樣式耗材進(jìn)行磁分離操作;恒溫震蕩模塊實(shí)現(xiàn)了溫度及轉(zhuǎn)速可調(diào)的孵育裝置，其溫度

8、均一性為±1℃，并設(shè)有5擋調(diào)速功能。整體系統(tǒng)以自動(dòng)化液體處理平臺(tái)為基礎(chǔ)，采用統(tǒng)一的電器控制方案，并提供可編程界面對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行在線設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了從樣本輸入到結(jié)果輸出的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程。
　　4.自動(dòng)化核酸分析系統(tǒng)的性能測試與臨床應(yīng)用
　　對(duì)于自動(dòng)化系統(tǒng)的移液性能測試，首先采用Bradford方法對(duì)自動(dòng)化及手工配制的BSA梯度稀釋液進(jìn)行測定，兩者標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度分別為0.984和0.974，重復(fù)性分別為2.00％和2.35％（CV

9、值）;其次，實(shí)驗(yàn)對(duì)多達(dá)20塊的96孔板進(jìn)行了重鉻酸鉀梯度稀釋液的配制，自動(dòng)化系統(tǒng)、手工8通道移液器及手工單通道移液器的操作重復(fù)性分別為1.94％，2.40％及4.54％;結(jié)果說明，自動(dòng)化系統(tǒng)的移液準(zhǔn)確性和重復(fù)性均優(yōu)于手工操作。接下來驗(yàn)證了自動(dòng)化核酸分析系統(tǒng)的樣本處理能力，具體為:對(duì)已知濃度的HBV質(zhì)粒樣本分別進(jìn)行自動(dòng)化及手工核酸提取操作，兩者提取效率分別為95.01％和94.7％;對(duì)高通量的E.coli核酸提取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，自動(dòng)化系統(tǒng)